輔 助 方 案 1 包 裹 DNA 的金粉顆粒的制備
可以參考表 , 表中概括了本操作中制備顆粒所需的各種值。
輔 助 方 案 2 制 備 包 裹 有 DNA 的金粉顆粒的樣品管
超聲水浴
分 光 光 度 計（可選）
1 . 按照操作說明，將氮氣罐同調節閥門和樣品管制備站連在一起。同 時 將 一 段 12?13in (30. 5?33 cm) 或更短的一段桂管通過 l /8in Luer 接頭連到 IOml 注射器上。如果沒有蠕動泵，準備第二個帶有接頭管的注射器用于去除乙醇。
如果使用 Powderject 的樣品管制備站，應使用一小段娃管（4in 或 10 cm)，將它同 IOml 注射器相連接，然后用封口膜封好。
2 . 室溫輕輕顛倒 DNA/金粉/乙醇的混合液。將裝有顆粒的圓錐底離心管放在超聲水浴中 5?IOs 直到不存在塊狀金粉。
3 . 用氮氣清除空的聚四氟乙烯管道中的水氣，時 間 不 少 于 15 min，有可能的話盡量長一些。將氮氣壓力調至 1?2psi。通過調節管道旋轉裝置，將氣流速度控制為 0.4?0. 5L/min
4 . 剪一段與管子轉頭相等的干燥的管道（約 30in 或 76. 2 cm) ，將此 管 與 IOml 注射器相連 ，再次輕輕顛倒 DNA/金粉懸液，用 注 射 器 將 懸 液（不多于 3 ml) 快速地抽至聚四氟乙烯管道中。管道的兩端留 2?3in (5?7. 6 cm) 的空管子，此段空管中不要有任何液體。不要取走注射器，要防止在管道中留有氣泡。
5 . 確認氮氣已經完全關閉，將上樣管道接到管子轉頭上，將 DNA/金粉懸液在管道中保 留 4?5 min。
6 . 拔去上樣注射器，將 蠕 動 泵（或者是第二個注射器）連接到樣品管。以 每 秒 0.5?lin (1.27?2. 54 cm) 的速率用蠕動泵（或者注射器）將乙醇去除。有一小部分金粉隨乙醇一起被去除是很常見的。
為了在 DNA/金粉/ 乙醇混合液中以準確的速率均勻地去除乙醇，可以在樣品管上 每 Iin 處做標記，用計時器定時，計算速度。此過程中不要用水，因為水會污染樣品管制備站。如果使用 Powderject 的樣品管制備站，上樣注射器可以留在樣品管上，一旦金下沉就可以去除乙醇了。
7 . 拆下蠕動泵，用管子轉頭以 20r/min 的轉速旋轉管道。轉動管子 30?45s，直到金粉顆粒均勻落在管道上。
8 . 通過調節閥，將氮氣的流速控制在 0.35?0.4L/min，使氮氣在樣品管中流動，讓樣品管充分干燥約 4 min，直 至 金 粉 從 黑 色（濕的）變 成 亮 棕 色（干的）。在管道末端看到一或兩滴金粉是很正常的，而過多的金粉則說明管道中有水存在。
9 . 停止轉動管道，關上氮氣，把管道從轉子上取下。對著燈光觀察管子中金粉分布情況 ，在金粉均勻分布的樣品管兩末端折縫或使用記號筆的方法做記號。只用有均勻涂層或絕大多數金涂層呈細金線的管道。
如果金粉沒有在管道內形成涂層，而形成一條很厚的金線，是因為乙醇去除的太慢了。如果金涂層呈漩渦或帶狀出現，是因為乙醇去除的太快了。如果金粉分布稀少或呈斑點狀，有可能是 DNA/金粉/ 乙醇制備過程中污染了水，需要進一步干燥(步驟 10)。
10.制備過程中污染水：記 下 制 備 好 的DNA/金粉/乙醇混合液體積，離心混合液，用新 鮮 的 無 水 乙 醇 洗 滌 沉 淀 3 ? 5 次。用 等 刻 度 的 新 鮮 無 水 乙 醇 重 懸 顆 粒 。用此DNA/金粉/乙 醇（步 驟 3?9 ) 混合液制備樣品管，空管子通氮氣凈化的時間要更長（步 驟 3?9)。有必要的話，可以等天氣不潮濕的時候來制備管道。
11.用 刀 片 把 做 過 記 號 的 管 道 切 下 來 ，扔 掉 不 要 的 一 段 。將 剩 下 的 管 子 切 成 0.5in(1.27 cm)，最好用樣品管切割儀或刀片切割管子。將管道放在有干燥劑的玻璃管中。用封口膜將蓋子封口。管子可在 4°C 存 放 8?1 2 個月。
12.可選操作：樣 品 管 中 DNA 含量的定量。將 5 個 樣 品 管 放 在 有 500ul 的 PH8. O 的T E 緩沖液的 1.5 ml 微量離心管中，超聲，直至金粉從管壁上脫落， DNA 復溶。最大轉速離心約 5 min。用分光光度計測上清 A26。值 ，計 算 D N A 的含量。理論上說包被時如果 1 0 0 % 的 DNA 都包裹在金粉顆粒上，那 么 每 個 樣 品 管 可 以 得 到 l Mg 的DNA，相當于 A260的值為 0.2
輔 助 方 案 3 基因槍接種中氦氣壓力和顆粒大小的最優化
1 . 麻 醉 小 鼠（見 基 本 方 案 1 ，步 驟 3a) ，用電動剃須刀給腹部剃毛。用基因槍在壓力100?500psi 范圍內，按 IOOpsi 的增量在不同點接種包裹 DNA 的 金 粉 顆 粒（見基本方 案 2)。每個條件下接種 2 次 ，確定在腹部皮膚上的接種位點沒有重疊，點與點外圈之間的距離約為0.5 cm，每個小鼠接種四個點。
2 . 用皮膚打孔機活檢接種過的點，這可在接種后數分鐘內進行。按皮膚的方向將活檢的皮膚放在 IinXlin 的卡片上。因為打過孔的地方很快就會愈合，不需要縫合。對進行過多次活檢的小鼠可以實行安樂死（附 錄 2 G)。
3 . 將卡片上的活組織放在切片盒中，用 4 % 的多聚甲醛固定組織。用石蠟包埋并切片(CPI單 元 21.4)。用伊紅染色，在顯微鏡下觀察切片中顆粒的深度。
在 所 有 的 切 片 中 ，在 角 質 層 、 表 皮 層 和 真 皮 層 都 可 以 發 現 顆 粒 。 對 各 層 中 的 顆粒進行計數，可以確定在哪種條件下，在表皮層的顆粒是占總量百分比最高的（通常 為 4 0 % ?6 0% ) 。一般地，采用的壓力變化至少在 IOOpsi 才會造成顆粒接種的深度明顯不同。
