一、增菌
樣品采集后應盡快檢驗。以無菌操作稱取檢樣25 g，加在225 mL營養肉湯中，以均質器打碎1 min或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養基，以測定大腸菌群MPN，其余的移入500 mL廣口瓶內，于36土1 ℃培養6 h。挑取1環，接種于1管30 mL腸道菌增菌肉場內，于42 ℃培養18 h。
二、分離
將乳糖發酵陽性的乳糖膽鹽發酵管和增菌液分別劃線接種麥康凱或伊紅美藍瓊脂平板；污染嚴重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線接種麥康凱或伊紅美藍平板，于36土1 ℃培養18 h一 24 h，觀察菌落。不但要注意乳糖發酵的菌落，同時也要注意乳糖不發酵和遲緩發酵的菌落。
三、生化試驗
1. 自鑒別平板上直接挑取數個菌落分別接種三糖鐵(TSl)或克氏雙糖鐵瓊脂(KI)。同時將這些培養物分別接種蛋白胨水、半固體、pH 7.2尿素、瓊脂、KCN肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗培養基。以上培養物均在36 ℃培養過夜。
2. TSI斜面產酸或不產酸，底層產酸，H2S陰性，KCN陰性和尿素陰性的培養物為大腸艾希氏菌。TSI底層不產酸，或H2S、KCN、尿素有任一項為陽性的培養物，均非大腸艾希氏菌。必要時做氧化酶試驗或革蘭氏染色鏡檢。
四、血清學試驗
1. 假定試驗
挑取經生化試驗證實為大腸艾希氏菌的瓊脂培養物，用致病性大腸艾希氏菌、侵襲性大腸艾希氏苗、產腸毒素大腸艾希氏菌多價O血清和出血性大腸艾希氏苗O157，血清做玻片凝集試驗。當與某一種多價O血清凝集時，再與該多價血清所包含的單價O血清做試驗。如與某一個單價O血清呈現強凝集反應，即為假定試驗陽性。
2. 證實實驗
制備O抗原懸液，稀釋至與MacFarland?3號比濁管相當的濃度。原效價為1:160—1:320的O血清，用0.％鹽水稀釋至1:40。稀釋血清與抗原懸液在10 mm×75 mm試管內等量混合，做試管凝集試驗。混勻后放于50 ℃水浴箱內，經16 h后觀察結果。如出現凝集，可證實為該O抗原。
五、腸毒素試驗
1. 酶聯免疫吸附試驗檢測LT和ST
（1）產毒培養
將試驗菌株和陽性及陰性對照菌株分別接種于0.6 mLCAYE培養基內，37 ℃振蕩培養過夜。加入20000 IU／ml的多粘菌素B0.05 mL，于37 ℃培養1h，4000 r／min離心15 min，分離上清液，加入0.1％硫柳汞0.05 ml，于4 ℃保存待用。
（2）LT檢測方法(雙抗體夾心法)
包被：先在產腸毒素大腸艾希氏菌CT和ST酶標診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管，加入包被液0.5 ml，混勻后全部吸出于3.6ml包被液中混勻，以每孔100 μl量加入到40孔聚苯乙烯硬反應板中，第一孔留空作對照，于4 ℃冰箱濕盒中過夜。
洗板：將板中溶液甩去，用洗滌液I洗3次，甩盡液體，翻轉反應板，在吸水紙上拍打，去盡孔中殘留液體。
封閉：每孔加100 μL封閉液，于37 ℃水浴中l h。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
加樣本：每孔分別加多種試驗菌株產毒培養液100 μl，37 ℃水浴中l h。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
加酶標抗體：先在酶標LT抗體管中加0.5 ml稀釋液，混勻后全部吸出于3.6 ml稀釋液中混勻，每孔加100 μl，37 ℃水浴中1 h。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
酶底物反應：每孔(包括第一孔)各加基質液100 μl，室溫下避光作用5 min~10 min，加入終液50 μl。
結果判定：以酶標儀在波長492 nm下測定吸光度0D值，待測標本OD值大于陰性對照3倍以上為陽性，目測顏色為桶黃色或明顯高于陰性對照為陽性。
（3）ST檢測方法(抗原競爭法)
包被：先在包被用ST抗原管中加0.5 ml包被液，混勻后全部吸出于1.6 ml包被液中混勻，以每孔50 μl加入于40孔聚苯乙烯軟反應板中。加液后輕輕敲板，使液體布滿孔底。第一孔留空作對照，置4 ℃冰箱濕盒中過夜。
洗板：用洗滌液I洗3次，操作同上。
封閉：每孔加100 μl封閉液，37 ℃水浴比。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
加樣本及ST單克隆抗體：每孔分別加各試驗菌株產毒培養液50μl、稀釋的ST單克隆抗體50 μl(先在ST單克隆抗體管中加0.5 mL稀釋液，混勻后全部吸出于1.6 ml稀釋液中，混合)，37 ℃水浴1 h。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
加酶標記兔抗鼠1 g復合物：先在酶標記免抗鼠1 g復合物管中加0.5 mL稀釋液，混勻后全部吸出于3.6 mL稀釋液中混勻，每孔加100 μl，37 ℃水浴1 h。
洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。
酶底板反應：每孔(包括第一孔)各加基質液100 μl，室溫下避光5 min~10 min，再加入終止液50 μl。
結果判定：以酶標儀在波長492 nm下測定吸光度OD值；目測無色或明顯淡于陰性對照為陽性。
2. 雙向瓊脂擴散試驗檢測LT
將被檢菌株按五點環形接種于E1ek氏培養基上。以同樣操作，共做兩份，于36 ℃培養48 h。在每株菌苔上放多粘菌素B紙片，于36 ℃經5 h～6 h，使腸毒素滲入瓊脂中，在距五點環形菌苔各5 mm處的中央，挖一個直徑4 mm的圓孔，并用一滴瓊脂墊底。在平板的中央孔內滴加LT抗毒素30 μl，用已知產LT和不產毒菌作對照，經15 h～20 h觀察結果。在菌斑和抗毒素孔之間出現白色沉淀帶者為陽性，無沉淀帶者為陰性。
3. 乳鼠灌胃試驗檢測ST
將被檢菌株接種于Honda氏產毒肉湯內，于36 ℃培養24 h，以3000 r／min離心30 min，取上清液經薄膜濾器過濾，加熱60 ℃30 min，每mL濾液內加入2％伊文思藍溶液0.02 mL。將此濾液用塑料小管注入1日齡一4日齡的乳鼠胃內0.1 mL，同時接種3只～4只，禁食3h～4 h后用三氯甲烷麻醉，取出全部腸管，稱量腸管(包括積液)重量及剩余體重。腸管重量與剩余體重之比大于0.09為陽性，0.07—0.09為可疑。
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