乙醇發酵實驗_發酵法

在無氧條件下，酵母菌利用己糖發酵生成乙醇和CO₂的作用，稱為乙醇發酵。目前乙醇發酵所采用的微生物主要是酵母菌。生產上所使用的酵母菌原菌一般是固體斜面試管菌種，由于起酵母數量太少，不夠生產之需，所以必須將斜面菌種進行若干次的擴大培養，以獲得含有足夠數量酵母菌的酵母培養物（通常是液體培養物，也有固體培養物的），以供乙醇發酵以用，故被稱為酒母。

K氏母菌酵母菌麥牙甘薯粉木薯粉

細菌淀粉酶瓊脂

接種杯酒精燈試管三角瓶燒杯水浴鍋恒溫培養箱蒸餾燒瓶冷凝管牛角管容量瓶量筒電爐石棉鐵絲網乙醇溫度計

一、酵母菌的擴大培養

1.  培養基的制備

酵母擴大培養中的試管和三角瓶培養用的基通常采用麥牙汁，其制備方法如下：將干麥牙磨碎，加入3.5倍量的65 ℃的熱水，在58～60 ℃的溫度下糖化3～4 h，以碘液檢查糖化完全后，將其煮沸、過濾，將濾液濃度調整到13^oBx。將上述制備好的麥牙汁進行分裝并滅菌。

（1）固體斜面使館培養基：取100 ML麥牙汁，加入2 %瓊脂，融化后分裝試管，一般培養基的裝量是試管容量的1/5。以121 ℃蒸汽滅菌20min，取出后趁熱置成斜面，放冷，斜面的長度為試管長度的1/2～3/5。

（2）液體試管培養基：用稀硫酸將麥牙汁pH調節至4～4.4，分裝于試管中，每支試管分裝5 ML。以121 ^oC蒸汽滅菌20 min。

（3）小三角瓶培養基：將pH調節至4～4.4的麥牙汁分裝于容量為150ML的三角瓶中，每瓶裝50ML，以131^oC蒸汽滅菌20 min。

2.  接種與擴大培養

（1）將斜面試管酵母原菌移接于固體斜面試管，于28～30 ℃下培養48 h。

（2）將上述培養好的斜面活化酵母菌種接一環于液體試管中，以28～30  ℃培養24 h。

（3）將上述液體試管酵母接種于小三角瓶中（每支試管接一個三角瓶），以28～30℃培養至對數期末（約16 h）。

3.  種子（酒母）質量要求

對培養好的三角瓶種子要進行質量檢查。鏡檢時要求酵母形態健壯整齊，細胞內原生質稠密，無雜菌，細胞數（0.8～1.0）×10⁸ 個/ML，出牙率20%～30 %，死亡率要小于1 %。

二、淀粉原料的蒸煮與糖化

1.  按甘薯粉或木薯粉的3.5倍量的加水比，用50～55 ℃的溫水與淀粉原料攪拌混合，添加原料量0.1%的細菌淀粉酶，于電爐上加熱并不斷攪拌，升溫至90～93 ℃，5～10 min，進行液化；繼續加熱煮沸1h，使淀粉充分糊化和液化，并適量補充水分。

2.  將上述蒸煮醪冷卻至60～62 ℃，添加180 u/g原料的糖化酶，用硫酸將醪液的pH調節至4～4.5，在水浴鍋上保溫糖化30 min，而后分裝于1000 mL的三角瓶中，每瓶裝糖化醪500 mL。

3.  糖化醪的質量要求：糖度15～17 °Bx，還原糖6 %～9 %，Ph4～4.5。

三、糖化醪的發酵

將培養成熟的小三角瓶酵母種子（酒母）以無蓖操作接入裝有500 mL糖化醪的大三角瓶中（每個小三角瓶中接一個大三角瓶，在30 ℃的溫度下發酵68～72h。

四、CO₂生成量的測定

測定乙醇發酵中CO₂生成量的裝置如圖5-1所示。其測定方法如下：

1.  發酵前，將三角瓶外壁擦干，置于1/100g的大平上稱重，記下質量為m₁。

2.  發酵完畢后，將三角瓶輕輕搖動，使CO₂盡量逸出。在同一架天平上再稱重，記下質量為m₂。

3.  CO₂生成量＝m₁-m₂。

五、乙醇度的測定

1.  安裝好蒸餾裝置。

2.  準確量取100 mL發酵成熟醪倒入500 Ml蒸餾瓶中，并加入等量的蒸餾水。蒸餾瓶用插有溫度計的膠塞塞緊，連接好冷凝管，勿使漏氣。用電爐加熱，同時接通冷卻氣，餾出液收集于100mL容量瓶中（如無容量瓶亦可直接用100 mL量筒收集）。待餾出液達到刻度時，立即停止收集（注意：不能超過刻度），倒入量筒中，稍加攪動，使之均勻，將酒精計與溫度計同時置入量筒，測定酒精度與溫度。

3.  根據測得的乙醇度與溫度，查換算表，得到溫度在20 ℃時的乙醇濃度。