微生物擬核體內體外染色觀察實驗_溴化乙錠染色法

如果將微生物細胞裂解，使其擬核（即染色體 DNA）被抽提出來，通過溴化乙淀（ethidium bromide，簡稱 EB）染色并進行瓊脂糖凝膠電泳，便可觀察到釋放到細胞外的染色體 DNA。EB 是一種扁平分子染料。可特異性插入 DNA 堿基對之間，在紫外線照射下，使 DNA 呈現熒光，因而可觀察到凝膠中的染色體 DNA，由于在提取過程中大分子染色體 DNA 的隨機斷裂，所以經凝膠電泳后形成的是一條不整齊的濃的熒光帶。

用 EB 染色法進行的體外觀察染色體 DNA 也分兩步進行：

1. 將細胞裂解后抽提染色體 DNA；

2. 通過含有 EB 的瓊脂糖凝膠電泳在紫外光下觀察染色體 DNA 熒光帶。

大腸桿菌

TE 緩沖液10% SDS蛋白酶 K（20 mg ml）5 mol L NaClCTAB NaCI酚 氯仿 異戊酵（25:24:1）異丙酵70% 乙醇溴酚藍加樣緩沖液TAE 電泳緩沖液

臺式高速離心機5 ml 塑料離心管真空干燥器

1. 取 4.5 ml 大腸桿菌過夜培養液于 5 ml 塑料離心管中，12000 r/min 離心 1～2 min，棄上清。

2. 將細胞沉淀懸浮于 1.7 ml TE 緩沖液中，加入 10% SDS 90 μl 和 20 mg/ml 的蛋白酶 K 9 μl 混勻，37℃ 保濕 1 h。

3. 加入 5 mol/L NaCl 300 μl，充分混勻，再加入 240 μl CTAB/NaCl，混勻，置 65℃ 水浴 10 min。

4. 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）混勻，12000 r/min 離心 5 min。

5. 將上清水相轉入另一潔凈的塑料離心管中，加 0.6 倍體積的異丙醇使 DNA 沉淀下來。

6. 快速離心數秒鐘，棄上清，用 70% 的乙醇淋洗 DNA 2 次，將 DNA 沉淀經真空干燥后溶于 300 μl TE 緩沖液中。

用此法獲得的染色體 DNA 可用于限制性酶切等分子生物學操作。

7. 取少量（約 3～5 μl）提取的 DNA 樣品（其余置于-20℃ 保存），加入 3 μl 溴酚藍加樣緩沖液，混勻后上樣進行瓊脂糖凝膠電泳 1 ～ 2 h。瓊脂糖中加有 EB，在電泳過程中，EB 將插入 DNA 分子中。

8. 戴上一次性塑料手套（EB 是強誘變劑）將凝膠取出置于紫外分析儀上觀察染色體 DNA 熒光帶。

必須通過一塊普通玻璃或戴上防護眼鏡進行現察，以免損傷眼晴。