細胞計數實驗——光電比濁計數法

當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出（圖 VIII-4）。因此，可用一系列已知菌數的菌懸液測定光密度。作出光密度--菌數標準曲線。然后，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數。制作標準曲線時菌體計數可采用血細胞計數板計數，平板菌落計數（見顯微鏡直接計數法實驗和平板菌落計數法實驗）或細胞干重測定等方法。

本實驗采用血細胞板計數。

光電比濁計數法的優點是簡便、迅速，可以連續測定，適合于自動控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態、培養液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對于不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數應采用相同的菌株和培養條件制作標準曲線。光波的選擇通常在 400～700 nm 之間，具體到某種微生物采用多少還需要經過最大吸收波長以及穩定性試驗來確定。另外，對于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質的懸液不適合用此法進行測定。

釀酒酵母培養液

無菌生理鹽水

721 型分光光度計血細胞計數板顯微鏡試管吸管吸水紙無菌吸管

1. 標準曲線制作

1.1 編號取無菌試管 7 支，分別用記號筆將試管編號為 1、2、3、4、5、6、7。

1.2 調整菌液濃度用血球計數板計數釀酒酵母培養液，并用無菌生理鹽水分別稀釋調整為每毫升 1×10⁶、2×10⁶、4×10⁶、6×10⁶、8×10⁶、10×10⁶、12×10⁶的細胞懸液。再分別裝入已編好的 1 至 7 號無菌試管中。

1.3 測 OD 值將 1 至 7 號不同濃度的菌懸液，搖勻后于 560 nm 波長，1 cm 比色杯中比色測定 OD 值。比色時，用無菌生理鹽水作空白對照，并將 OD 值填入下表。

1.4 以光密度（OD）為縱坐標，每毫升細胞數為橫坐標，繪制標準曲線。

2. 樣品測定

將待測的樣品用無菌生理鹽水適當稀釋，搖勻后，用 1 cm 比色杯，560 nm 波長測定光密度。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。

3. 根據所測光密度值，從標準曲線查得每毫升的含菌數。

1. 每管菌懸液在測定 OD 值時均必須先搖勻后再倒入比色皿中測定。

2. 各種操作條件必須與制作標準曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數就不準確。