牛乳在自然發酵與酸敗過程中細菌的生態演變實驗

由于牛乳的特殊形態，剛采集的生牛乳含有少量不同的細菌，而牛乳的成分對細菌來講是一種很好的營養基質，因此，在溫暖的條件下，細菌即開始很快地繁殖。然而也不是所有的細菌都能如此，由于當時生牛乳的 pH 是中性，含有豐富的乳糖，故有利于其中自然存在的乳酸細菌例如乳鏈球菌（Streptococcus lactis）很快地繁殖。它們發酵乳糖產生乳酸，使牛乳的 pH 降低，并引起蛋白質凝結成乳酪狀。這低的 PH 最終抑制了乳鏈球菌的繁殖，被比較能耐受低 pH 的發酵乳糖的菌種乳桿菌（Lactobacillus）所代替，它們完成乳糖發酵，并使 pH 更加降低。接著是酵母菌在這種低 pH 下利用乳酸而生長。隨著乳糖和乳酸的消失，pH 再度上升，假單孢菌（Pseudomonas）和芽胞桿菌（Bacillus）能產生蛋白酶，開始分解凝結了的牛乳蛋白質，當蛋白質被利用完畢，牛奶的分解也就完成了。

生牛乳的這種生態學演變的自然過程是一個典型的例子。原始細菌的活動為以后的細菌創造了有利的生化條件，因而能觀察到一個微生物群體接替另一微生物群體的一系列演變。這種自然演變的基本原則也能在地面環境中的高等植物和動物中實現。自然界其他微生物也會發生同樣的演變過程。

巴斯德消毒法的目的是殺滅牛乳中的病原菌，但不能殺滅芽胞桿菌，用此法消毒過的牛乳，破壞了其中的正常菌群（除芽胞桿菌以外），因而不能產生帶酸味的酸牛乳——典型的乳酪牛乳，但能越過演變的早期而趨向于更不適用的最后時期。故牛乳酸敗的自然過程與食品工業有密切的關系。現代工業生產的酸牛乳是先將牛乳進行消毒，而后接種乳鏈球菌與乳桿菌的純種發酵制成。目前市場上銷售的鮮牛乳，除采用巴氏消毒法消毒外，還有高溫消毒和超 高溫瞬時消毒，制備更高品質的牛乳。

本實驗是將生牛乳原始樣品與以后培養在 30℃ 下約每兩天取一次的樣品分別測其 pH 和涂片，進行革蘭氏染色，油鏡下觀察主要細胞的形態、排列、革蘭氏陽性或陰性以及單個視野中的平均細菌數。由于每次涂片均取一個接種環，涂抹玻片約 2.5 cm² 的面積，因此，所測菌數的結果將是半定量的。

生牛乳樣品

革蘭氏染液二甲苯

中性到酸性的 pH 試紙玻片顯微鏡

1. 旋轉裝牛乳的三角燒瓶，使樣品充分混勻。

2. 用滅菌滴管或接種環以無菌操作取一滴牛乳，放在 pH 試紙上比色，將結果記錄于「結果」的表格內。

3. 用無菌操作取滿一接種環牛乳，在玻片上均勻涂抹 2.5 cm² 面積（可先在紙上畫 2.5 cm² 的方格，然后將玻片放在紙上），玻片標明日期。

4. 玻片放空氣中干燥。貯存在一有蓋盒內，待整個實驗的所有涂片制成后一起進行「7」以后的步驟或每片先進行第「7」步驟，再貯存，待所有玻片制成后再進行「8」以后的步驟。

5. 牛乳樣品放 30℃ 溫箱內培養。整個實驗（約需 10 d）均需在此溫度下培養。

6. 每兩天重復取樣測 pH 和制作涂片。每次制作涂片用同一接種環，取同樣的量。直至牛乳完成變酸過程和開始腐敗為止。

7. 所有涂片都用二甲苯處理約 1 min，以除去牛乳的脂肪，干燥后，火焰固定。

8. 革蘭氏染色。

9. 油鏡下觀察，數幾個視野的主要類型的細菌數，計算每一視野的平均數，描寫細菌類型，注明形態（桿狀或球狀）、大小（長或短，細長或寬大）以及排列（單個或呈鏈狀）等。

整個生態演變過程可分為四個時期，下面介紹每一時期的 pH 與主要細菌及細菌的特點，作為記錄與解釋所得結果的指導。但不能指望每組結果與這一指導完全一致，因為此實驗結果常因原始樣品中細菌的數量和種類、培養溫度和其他環境因素的不同而不同的。

第一時期（pH6.0～7.0）乳鏈球菌：革蘭氏陽性，呈鏈狀排列。在中性 pH 下繁殖與發酵乳糖而產生乳酸。

第二時期（pH 3.5～4.0）乳桿菌屬：細長的革蘭氏陽性桿菌，常呈鏈狀，在比較低的 pH 下繁殖，完成乳糖的發酵。

第三時期（pH 4.0～5. 0）酵母菌：大革蘭氏陽性、卵圓形細胞，在低 pH 下繁殖，利用乳酸，因而 pH 再次增高。

第四時期（pH 5. 0～6.5）腐敗微生物：有假單胞菌屬和芽孢桿菌屬。假單胞菌屬為小革蘭氏陰性桿菌，單個存在；芽孢桿菌屬為大革蘭氏陽性桿菌，常呈鏈狀，當營養耗盡時還可能產生芽孢。它們在較高的更堿性的 pH 下繁殖，消化蛋白質凝乳和利用氨基酸作為營養物質。