小鼠睪丸／輸精管精子采集、運動能力檢測與結構觀察實驗

哺乳動物的精子形成后必須經過在附睪內發生一系列形態、生理和生化方面的變化而最終達到成熟后，才能獲得向前運動的能力，這種向前運動是精子受精能力的重要指標。哺乳動物精子包括頭部和尾部二個主要部分，頸部介于頭部和尾部之間，形成頭部和尾部的連接。精子頭部主要由核組成，頭部前端是頂體，頂體包圍核的前端形成帽狀。精子頸部變細并形成頭部和尾部的連接。尾部是精子的運動器官，可以分為中段、主段和末段。 

小鼠

龍膽紫酒精福爾馬林磷酸鹽緩沖液姬姆薩液

吸水紙滴瓶滴管載玻片蓋玻片剪刀膠布記號筆隔水式恒溫培養箱CZB液KSOM液注射器器械盤鑷子手術剪眼科剪眼科鑷眼科異物針表玻皿試管顯微鏡擦鏡紙恒溫水浴鍋血球計數板

一、精子采集

左手捏小鼠尾部，右手持鑷子，或以圖4-1所示方法，以頸部脫臼法處死實驗鼠。使處死的小鼠仰臥，用用75 %酒精棉球消毒腹部開口部位被毛及皮膚。剪開腹壁，暴露生殖系統。無菌采取分離睪丸、附睪及輸精管。在含培養液的表玻皿中，用眼科剪除去睪丸、附睪及輸精管周圍的系膜及脂肪，并沖洗干凈，以免血液或脂肪球混入液體妨礙精子觀察。

將分離并清洗干凈的睪丸、附睪及輸精管，用眼科剪再分離為睪丸、附睪尾及附帶的小段輸精管、其余部分的輸精管三部分，棄去附睪頭。采集睪丸精子時，將睪丸橫切為若干段或組織塊，在表面皿中，加1 mL培養液，用眼科鑷子輕輕擠壓睪丸組織塊，把精子擠入培養液中，去掉組織塊。于37 ℃、5%CO₂、飽和濕度條件下孵育20分鐘，使精子自行散開。

采集附睪尾精子時，將其剪成幾段，用眼科鑷子輕輕擠壓附睪和輸精管，把精子擠入培養液中，去掉附睪和輸精管。于37 ℃、5%CO₂、飽和濕度條件下孵育20分鐘，使精子自行散開。采集輸精管精子時，由于小鼠輸精管非常細，不能直接沖洗管腔，將輸精管放入含有1mL 培養液的表面皿內，在實體顯微鏡下，用一支眼科用異物針固定輸精管，用另一支異物針向相反方向縱向撕開輸精管，精子會浮游到稀釋液中。將大塊輸精管組織撥開，用吸管連同精子吸出液體部分，裝于2 mL具塞試管中暫存。

二、精子運動能力檢查

用滴管吸取精液，放于血球計數板的計數室與蓋玻片接觸處，使精液自然流入計數室中。計數中間5個中方格(對角5個或四角及中間)內80個小方格的精子數，計數值為X。計算時，先計數死精子的X₁值，將計數板置于50 ℃水浴鍋中的搪瓷盤中，在50 ℃條件下10 min殺死精子，計數總精子數X₂值，(X₂-X₁)/X₂為精子運動能力。計數時每份精子用三個計數板重復計數三次，取平均值。

三、精子整體結構觀察

取1小滴保存精液在載玻片上，將樣品滴以拉的形式制成抹片。用0.5 %龍膽紫酒精染色3min,自然干燥、水洗后鏡檢。鏡下可觀察到大多數為結構正常的精子，部分為畸形精子，如頭部畸形(如頭部巨大、瘦小、細長、圓形、輪廓不明顯、皺縮、缺損、雙頭等)，頸部畸形(頸部膨大、纖細、屈折、不全、雙頸等)，尾部中段畸形(膨大、纖細、彎曲、屈折、不全、雙體等)，尾部主段畸形(彎曲、屈折、回旋、短小、長大、雙尾等)分類計數。有的精子尾部發育未完成，為未成熟精子，可視為畸形精子。

四、精子頂體結構觀察

精液抹片自然干燥2～20 min，以1～2mL的福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定15 min，水洗后自然干燥。用姬姆薩工作液染色90 min，水洗，風干。置于1000倍顯微鏡下用油鏡觀察、計數頂體異常精子。鏡下可觀察到大多數精子頂體結構正常，部分精子頂體異常，精子頂體異常主要表現為腫脹、缺損、部分或完全脫落。

在含培養液的表玻皿中，用眼科剪除去睪丸、附睪及輸精管周圍的系膜及脂肪，并沖洗干凈，以免血液或脂肪球混入液體妨礙精子觀察。