1. 組織培養基的準備
( 1 ) 首先準備所需濃度 2 倍的植物凝膠，高壓滅菌（見注 2 ) 。
( 2 ) 所有的組織培養基都要過濾滅菌，因此除了無菌的儲備液，其他培養基成分按所需濃度 2 倍的量混勻，調到合適的 pH 后過濾滅菌（使用瓶頂過濾器、0.22 μm 微孔濾膜）。
( 3 ) 使用前將 2x 凝膠和 2x 培養基在水浴鍋中加熱至 60℃。
( 4 ) 將所需儲備液在無菌條件下加入到熱的培養基中，培養基和植物凝膠混合后倒入 9 cm 培養皿中（Sterilin)。
( 5 ) 分化培養時，使用高培養皿（100 mmx 20 mm，Falcon) 。
( 6 ) 滲透處理時，使用 5 cm 小培養皿 （Sterilin) 。
2. 幼胚的分離
(1) 幼穗的采收與消毒
① 當幼胚直徑長到 1~2 mm 時米收麥穗（見注 3) 。
② 在取麥穗之前，從每一穗中間取一粒種子，查看幼胚的大小，確保達到所需的要求 [ 可參考第 9 章「農桿菌介導的大麥轉化方法」，圖 9.2 (a ) ~（c ) ] 。
③ 將種子從穗子上取下來，去芒，但不要破壞種殼。
④ 先用 70% 的乙醇沖洗 30s，再用蒸餾水沖洗 3 遍，然后在次氯酸鈉（Fluka 71696) 與水比例為 50：50 的溶液中浸泡 4 min，再用蒸餾水沖洗 4 遍 ，最后將水倒掉但保持種子濕潤，置于無菌的螺口瓶中待用。
(2) 分離幼胚摘除胚軸
所有的操作均在超凈臺中進行：
① 每次大約取 20 粒無菌種子，置于解剖鏡無菌的藍色或黑色底板上，用一只鑷子固定種子，另一只懾子剝出幼胚，去除胚軸（見注 4) 。
( 2 ) 每皿愈傷誘導培養基放 25~30 枚幼胚，盾片朝上，25℃ 暗培養。
3. 制備 DNA 包裹的金粉微粒
(1) 制備金粉母液
DNA 包裹金粉微粒的方法與文獻 [ 9 ] 中的方法相似
① 稱 40 mg 金粉于 1.5 ml EP 管中，加入 1 ml 100% 乙醇。
② 渦旋振蕩使金粉充分混勻，離心使其沉淀。
③ 倒掉乙醇，重復步驟 2 兩次。
④ 最后一次離心后，去除乙醇，加入 1 ml 無菌水渦旋振蕩使之重懸。
⑤ 將金粉以 50 μl 分裝于無菌的 EP 管中，分裝時注意不斷混合以保持金粉顆粒處于懸浮狀態，分裝后保存在 -20°C 。
(2) 亞精胺制備
① 將裝有 1 g 亞精胺（Sigma- Aldrich) 的瓶子置于 65°C 水浴鍋中加熱使之融化。
② 用移液槍取 14 μl 溶液分裝于無菌的 1.5 ml 離心管中，-20℃ 儲存待用。
(3) 金粉微粒的包裹
① 從冰箱中取出亞精胺，并使其解凍。
② 加入 986 μl 無菌水，渦旋振蕩混合。
③ 用 1 ml 過濾器和小的過濾器濾頭（Minisart 0.2 μm 過濾器，Sartorius) 將溶液過濾到無菌的 1.5 ml 離心管中，制成 0.1 mol/L 亞精胺溶液。
④ 從冰箱中取出一管 50 μl 的金粉并使之解凍。
⑤ 沿裝有金粉的離心管管壁，加入 5 μl DNA ( 1 μg/μl) ，立即渦旋振蕩使金粉和 DNA 充分混合（見注 5) 。
⑥ 然后將 50 μl 2.5 mol/L CaCl2 和 20 μl 0.1 mol/L 亞精胺加入到離心管管蓋中，蓋好蓋子，顛倒離心管使 CaCl2 和亞精胺與金粉顆粒混合（顛倒離心管之前不能讓 CaCl2 和亞精胺與金粉顆粒混合），立刻渦旋振蕩使所有組分充分混合。
⑦ 管子在冰上放置 1 min，然后于 1957 g 離心不超過 30 s，使金粉沉淀。
⑧ 去除上清液，加入 250 μl 100% 乙醇，用槍頭輕輕吹打混勻，然后渦旋振蕩，這個過程是洗滌包埋了 DNA 的金粉微粒。
⑨ 1957 g 離心不超過 30 s 沉淀金粉微粒，去除上清，加入 60 μl 100% 乙醇。
⑩ 渦旋振蕩重懸金粉顆粒。DNA 包埋的金粉微粒即微載體已制備完畢。
4. 粒子轟擊幼胚
(1) 幼胚滲透處理
轟擊前，取分離 1 天后的幼胚，放在高滲培養基中處理 4 h。每皿 20~30 枚幼胚，置于培養皿中心 1.6 cm2 范圍內，盾片朝上。胚可以放得緊密一些，但相互之間不要碰到。轟擊之后幼胚繼續高滲處理 16 h。
(2) 基因槍準備
① 基因槍所有組件和內部的槍體都要用 100% 乙醇清洗消毒。終止屏和載體膜浸泡在乙醇中消毒，然后晾干。破裂盤在用之前浸泡在異丙醇中，無需再消毒。
② 載體膜晾干后，先放入載體膜支架，然后吸取 3.5 μl 包裹了 DNA 的金粉微粒點到每張載體膜中央。吸取金粉微粒時注意保持懸浮狀態。
(3) 基因槍參數
基因槍的各個組件在轟擊室的位置如下：
破裂盤和載體膜之間的距離：2.2 cm
載體膜和終止屏之間的距離：1.3 cm
終止屏和樣品架之間的距離：5.8 cm (槍體基部往上第三擋）
真空度：28 in.Hg.
(4) 粒子轟擊
① 在轟擊幼胚之前，基因槍先空轟擊兩次（見注 6) 。
② 將 1100 psi 的破裂盤在異丙醇中浸泡后放置在破裂盤固定帽內，然后將固定帽連接到基因槍腔體內的氮氣氣體加速管，基部旋緊。
③ 將終止屏放入微載體發射組件中，然后把點有金粉微粒并已干燥的載體膜放入載體膜支架，安裝在固定槽中（載體膜有金粉微粒的一面朝下），旋上蓋子，將微載體發射組件放在破裂盤固定帽下面的位置上。
④ 把放有幼胚的培養皿放在樣品架上，樣品架置于從轟擊室底往上數的第三擋上，拿走培養皿蓋，關上轟擊室門，抽真空使真空度達到 28 in.Hg 后保持，然后轟擊。
⑤ 當真空釋放后，打開轟擊室門，放回培養皿蓋，準備下一次轟擊。
⑥ 轟擊后的幼胚在 25°C 暗培養。
5. 轉化子篩選
( 1 ) 轟擊后 16 h，將幼胚從高滲培養基轉移到含有 5 mg/L 雙丙氨膦的愈傷組織誘導培養基中進行選擇，25℃ 暗培養。
( 2 ) 每隔兩周更換一次含有 5 mg/L 雙丙氨膦的愈傷組織誘導培養基。
( 3 ) 選擇培養 4 周后，即第二次更換培養基時，將來源于同一個幼胚的愈傷組織分成 3~6 個小塊，并做好標記，保證來源于同一個幼胚的所有愈傷組織在一起。
( 4 ) 選擇培養 6 周后，即第三次更換培養基時，將剩余健康的愈傷組織轉移到含有 1 mg/L 雙丙氨膦的過渡培養基中，在 25℃ 弱光下培養，即把培養皿放到有光照的組織培養室中，在每個培養皿上蓋一張薄紙片。
6. 轉基因植株再生
( 1 ) 在過渡培養基上培養兩周后，將來源于同一個幼胚的組織轉移到再生培養基上（圖 8.2) 。用深度大的培養皿，培養基不加任何生長調節劑，只含有 1 mg/L 雙丙氨膦。每 2 周用同樣的培養基進行繼代，直到不再有新的再生苗長出。
( 2 ) 當幼苗的芽長到 2~3 cm，也形成根時，從培養皿中移出轉移到含有 12 ml 愈傷誘導培養基的玻璃試管（Sigma C-5916) 中。培養基不加任何生長調節劑，只含有 1 mg/L 的雙丙氨膦。
( 3 ) 當長根的幼苗長到試管頂部，就可以轉移到土壤中。用長鑷子輕輕地將幼苗從試管中移出，根部的組織培養基用水沖洗干凈。
( 4 ) 將幼苗用同樣的大麥生長介質種在直徑為 5 cm 的盆中，幼苗上面蓋一個有孔的塑料杯以保持濕度，直到幼苗在土壤中定植良好。
( 5 ) 當幼苗在土壤中扎根后，就可以采集葉片分析目的基因是否存在。雙丙氨膦選擇不像潮霉素選擇那樣（詳見第 9 章 「農桿菌介導的大麥轉化方法」），一些非轉化的植株也可能存活。
( 6 ) 快速簡易的檢測再生植株轉化狀態的方法是用葉片進行除草劑抗性測試 [8]。
7. 用基因槍進行瞬時檢測
基因槍轟擊的一個重要用途是進行瞬時分析，常用于穩定轉化前對載體的檢測。在瞬時分析時，裝有幼胚的培養皿一般轟擊兩次以提高 DNA 的轉化量，建議在兩次轟擊間以 90° 角轉動培養皿（見注 7 ) 。圖 8.3 ( a ) 和圖 8.3 ( b ) 分別是用含有葡萄糖苷酸酶基因( gus ) 和綠色突光蛋白基因（gfp）的金粉微粒轟擊幼胚后進行瞬時表達的兩個示例。
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