3. 糖基釋放后的蛋白質分析
1 ) 糖基釋放的化學處理方法
還原性氨化反可應選擇性的解離糖蛋白上的 O-糖苷（見注釋 10) 。去糖基化的蛋白用 1D SDS-PAGE 分析，將其遷移情況與其糖基化形式的蛋白進行比較，電泳遷移率的增加是 O-連糖苷出現在蛋白上的證據（見注釋 11)。
( 1 ) 將 1 mg 純化的蛋白樣品放入帶聚四氟乙烯涂層的螺旋蓋子的玻璃管中，進行凍干處理。
( 2 ) 將干燥樣品溶解于 500 μl 硼氫化鈉溶液中，蓋緊玻璃管，37°C 過夜放置。
( 3 ) 逐滴添加乙酸來終止還原性氨化反應，直至無氣體產生。再加入 500 μl 的 10% 乙酸甲醇溶液。在通風櫥內風干。重復洗滌過程 3 次以洗去剩余的硼酸鹽。
( 4 ) 去糖基化處理后，去糖基化蛋白用 4 倍體積的乙醇于 -20°C 過夜沉淀處理，用合適的緩沖液溶解沉淀物用于 1D SDS-PAGE。同時可回收乙醇相中的糖苷，用于單糖組分分析（見 25. 3.2 節 2) 。
2) N-或 O-糖苷酶的酶促處理
用糖苷酶處理純化獲得的糖蛋白可得到進一步的信息。內切糖苷酶 H ( Endo H ) 只能通過水解 N-糖苷中心的兩個 GlcNAc 殘基之間的糖苷鍵，來解離植物糖蛋白中的高甘露糖型的 N-糖苷（圖 25-3)。多肽 N-糖苷酶（ PNGase) 通過水解位于肽鏈骨架天冬酰胺和寡聚糖近端 GlcNAc 之間的鍵，解離高甘露糖 N-糖苷和復合 N-糖苷。PNGaseF，一種被廣泛應用于哺乳動物糖蛋白分析的 N-糖苷酶，可解離高甘露糖 N- 糖苷和復合 N-糖苷，但不能水解與鄰近 GlcNAc 連接的 α-1-3-巖藻糖殘基。PNGaseA 可解離所有類型的植物糖苷（圖 25-3)，但它幾乎只對糖肽起作用，所以需要在去糖基化之前酶解糖蛋白 [23，24] 。糖蛋白或肽的去糖基化分析方法有：①電泳遷移的增加；② Endo H 或 PNGaseF 處理后，糖蛋白對糖苷特異性探針免疫活性的喪失；③ EndoH、 PNGase F 或 PNGase A 處理后的質譜分析。對于 O-糖苷酶可以采用同樣的手段和方法，但是我們實驗室很少用，因此不在此詳述（詳情見參考文獻 25 和 26)。
內切糖苷酶 H 去糖基化。
( 1 ) 在用 EndoH 去糖基化酶促處理之前，將純化獲得的蛋白質在 1% SDS ( m/V）存在下，100°C 加熱變性處理 5 min。
( 2 ) 用 150 mmol/L 乙酸鈉溶液（pH 5.7 ) 將樣品稀釋 5 倍，加入 10 mU 的 Endo H，將混合液在 37°C 溫育 6 h。
( 3 ) 如果酶切后要進行電泳、親和反應或者免疫檢測，那么，要在去糖基化反應后，加入等體積的兩倍濃度的電泳樣品緩沖液（見 25.3. 2 節 1) ，酶切處理后的樣品也可脫鹽處理，用于質譜分析。
肽 N-糖苷酶 F去糖基化：
( 1 ) 用 含 0.1% SDS 的 0.1 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5 ) 消化處理待酶切的蛋白樣品。
( 2 ) 樣品在 100℃ 加熱 5 min，將蛋白質變性。室溫下降溫，然后加入含 0.5% Nonidet P-40 的等體積的 0.1 mmol/L Tris- HCl，pH 7.5 ( 見注釋 12)。
( 3 ) 用肽 N-糖苷酶 F 37°C 溫育樣品 24 h ( 1 U 酶/100 μg 蛋白用）。
( 4 ) 酶解消化后，用 4 倍體積的乙醇在 -20°C，過夜沉淀去糖基化蛋白質。
( 5 ) 離心樣品。回收沉淀中的去糖基化蛋白，并將其溶解在適當的緩沖液中，供凝膠電泳和質譜分析。
肽 N-糖苷酶 A 去糖基化：
( 1 ) 將 100 μg 蛋白質樣品溶解在 500 μl 的 10 mmol/L HCl ( pH 2.2 ) 中，加入 10 μg 胃蛋白酶，37°C 消化 24 h，再次加入同樣量的胃蛋白酶，繼續消化 24h。100°C 加熱 5 min 終止反應。
( 2 ) 冷卻樣品，然后取 10% 的溶液用 C18 色譜柱純化肽和糖肽混合物。
( 3 ) 用 5 mL 乙腈沖洗 C18 層析柱，再用 5 mL 水沖洗 C18 層析柱。用蒸餾水將稀釋的樣品定容至終容積為 1 ml，加樣到 C18 層析柱。用 5 mL 水沖洗柱子去除樣品中的鹽分，用 5 ml 乙腈洗脫結合到柱子上的肽。吹干乙腈濃縮肽樣品。用 MALDI-TOF 質譜檢測肽和糖肽的分子質量，這樣可在內切糖苷酶 A 處理之前，獲得糖肽的質量數據。
( 4 ) 將剩余的樣品冷凍干燥，溶解在 500 μl 的 100 mmol/L 乙酸鈉溶液（pH 5.5 ) 中。
( 5 ) 將樣品用 0.1 mU 肽 N-糖苷酶 A 在 37°C 消化 18 h。然后冷凍干燥樣 品，用 C18 色譜柱，按照步驟（2 ) 和 步驟（3 ) 的操作，將肽與寡聚糖分開。通過 MALDI-TOF 質譜分析去糖基化肽，比較去糖基化處理前后得到的兩種譜型，得到一些由于 N- 糖苷的去除引起的離子質量差異，結合去糖基化過程中所使用的酶和植物糖蛋白的信息，來判斷蛋白質上 N-糖苷的種類和結構形式。
這個實驗所需要的試劑都包含在檢測試劑盒中，商品酶促去糖基化試劑盒由 Prozyme 公司生產。需要說明的是，按廠家說明使用該試劑盒。實驗者可以獲得有關被測糖蛋白上的糖苷類型（N - 和 O- 連接）的信息。
3.3 我的糖基化蛋白在哪
實驗人員可通過這個方法獲得關于糖苷在蛋白骨架上的分布及糖苷本身的結構信息。這類實驗可在純化的糖蛋白或者從 1D 或 2D 電泳膠上分離出來的蛋白上進行，首先，用蛋白內切酶消化蛋白質，通過高效液相色譜（HPLC) 分離消化后的肽和糖肽混合物。對含有糖苷的收集組分進行糖組分分析（見 25.3.2 節 2 ) ，接著分別對肽 N-糖苷酶 A 處理前后的糖肽組分進行 MALDI- TOF 質譜分析 [ 見 25.3.2 節 3)] 。
( 1 ) 將 1 mg 純化得到的蛋白質樣品溶解在 500 μl 的 50 mmol/L 碳 酸氫銨溶液（pH 8.0 ) 中，100°C 加熱 3 min。
( 2 ) 加入 50 μg TPCK 處理胰酶，在 37°C 處理 2 h。
( 3 ) 再次加入 50 μg TPCK 處理胰酶，37°C 處理 2 h。
( 4 ) 如果進行雙酶切處理，用 50 mmol/L 碳酸氫銨溶液（pH 8.0 ) 溶解 50 μg TPCK 處理糜蛋白酶，將其加到胰蛋白酶消化液中。37°C 處理 2h。
( 5 ) 100°C 加熱 5 min 終止蛋白酶消化反應。
( 6 ) 用反向 HPLC 色譜（C18 色譜柱）分離胰蛋白酶/糜蛋白酶消化得到的肽和糖肽，使用 0~60% B 溶液的 60 min 線性梯度洗脫，流速為 1 ml/min，214 nm 紫外監測洗脫峰。A 溶液：含 0.1% TFA (三氟乙酸）的水/乙腈 （90 : 10 ) 溶液。B 溶液：含 0.1% TFA 的水/乙腈（10 : 90 )溶液。收集各組分容積為 2 ml，冷凍干燥收集到的 組分。
( 7 ) 各取 10% 的收集組分進行糖組分分析（見 25. 3.2 節 2 ) ，挑選含寡聚糖的組分。
( 8 ) 用 MALDI-TOF 質譜分析含糖肽的 HPLC 組分確定糖肽的質量。
( 9 ) 用肽 N-糖苷酶 A 消化糖肽 [ 見 25. 3. 2 節 3. 2)]。如前所述用 C18 色譜柱將肽 和寡聚糖分開 [ 見 25.3.2 節 3. 2)]。
( 10 ) 用 MALDI- TOF 質譜分析去糖基化肽，確定其質量。這些質量數據幫助實驗人員鑒定被測蛋白質的糖基化位點。檢測到的糖基化和去糖基化肽的質量差異將為我們提供糖蛋白上糖苷的結構信息（ 表 25-2)。
本實驗方法也可以應用于未知序列的蛋白質。在這種情況下，用 LC-MS/MS ( 液相串聯質譜）分析、確定糖基化肽的氨基酸序列。解離下來的糖苷也可以采用前述的特定流程的 MALDI-TOF 質譜純化和鑒定 [18，19] 。
3.4 怎樣對全糖蛋白質組進行分析
植物提取物內糖蛋白的鑒定可確定以下幾點：① 哪些基因編碼糖蛋白。② 潛在糖基化位點上的哪些位點確實發生了糖基化。③ 糖蛋白上的糖苷的特性與結構是什么。這些研究過程現被稱為糖蛋白質組學。在動物細胞中已經實現了這些鑒定實驗，但在植物糖蛋白質組鑒定方面還未見報道。
我們實驗室最近開發的研究植物糖蛋白質組的策略依賴于固定化凝集素的純化，1D 或 2D 電泳的分離，以及質譜鑒定。糖蛋白質組的分離有以下兩種方法：含高甘露糖型 N-糖苷的分泌糖蛋白的純化和 O-GlcNAc 糖基化修飾的糖蛋白的純化。這里只著重介紹糖蛋白的選擇方法，不具體介紹電泳和質譜鑒定。有關這些技術的詳細信息請參見本書其他章節。
1. 含高甘露糖型 N-糖苷糖蛋白的鑒定
本方法是我們實驗室以油菜籽為實驗材料建立的，本方法也適用于其他植物材料。
( 1 ) 將 6 g 植物材料放入 4°C 預冷的研缽中，加入 50 ml 預冷的 TBS 緩沖液，研磨萃取蛋白質（見注釋 13)，接著 10000 g 離心萃取物 30 min，去掉不溶物，然后 150000 g 離心 1 h，沉淀膜碎片。用 Bradford 蛋白檢測方法測定上清液中的可溶性蛋白濃度。將樣品分裝成每份含 20 mg 蛋白質，冷凍存備用。
( 2 ) 4°C 解凍一份 20 mg 的樣品，10000 g 離心 30 min，0.20 μm 過濾膜過濾去除所有的不溶物。加入冷 TBS 緩沖液定容至 35 ml，加入 CaCl2和 MgCl2 至終濃度為 1 mmol/L。
( 3 ) 將相當于 1 ml 刀豆蛋白 A-瓊脂糖樹脂重懸在 50 ml TBS 緩沖液中，用 50 ml 的 TBS 緩沖液沖洗樹脂 2 次 ，每次沖洗后通過沉降或者離心（3500 g，10 min) 回收樹脂。
( 4 ) 洗漆后的樹脂與 35 ml 樣品于 4°C，在旋轉振蕩器上振蕩 2 h。將樹脂倒入 PolyPrep 柱子中，沖洗去除未結合在柱子上的蛋白質。
( 5 ) 先用 50 ml TBS 緩沖液沖洗樹脂 5 次，再用 50 ml TBS 緩沖液沖洗樹脂 5 次，然后如步驟（3 ) 所述方法，用 50 ml TBS 緩沖液重懸樹脂。
( 6 ) 將樹脂倒入 Poly- Prep 柱子中，去除殘余的 TBS 緩沖液，用 10 ml 含 0.3 mol/L α-甲基甘露糖 TBS 緩沖液重懸柱子中的樹脂。置于 4°C 旋轉振蕩 1 h ( 見注釋 14)。
( 7 ) 用 15 倍體積的含 0.3 mol/L α-甲基甘露糖的 TBS 緩沖液洗脫糖蛋白，用同樣的溶液沖洗樹脂，混合這兩部分樣品，最終的混合物就是純化的連接高甘露糖型 N-糖苷的糖蛋白。
( 8 ) 用 Bradford 蛋白檢測方法確定蛋白濃度，在 12.5% 三氯乙酸（最終濃度）中，4°C 過夜沉淀糖蛋白樣品。10000 g 離心 15 min 沉淀蛋白，用丙酮/水 [ 9 : 1 ( V/V )] 溶液沖洗沉淀，再次離心。重復洗滌過程兩次，將蛋白質溶解在適當的樣品緩沖液中供 2D 電泳分析用。
( 9 ) 用 2D 凝膠分離糖蛋白，蛋白點通過膠態藍染色。分別收集每個可視的點（見注釋 15)。胰蛋白酶酶解收集到的蛋白點。用 LC-MS/MS 分析酶消化產物。提交獲得的肽段序列信息到 NCBI 非冗余數據庫在可選擇的物種限制范圍內，進行 “短的、幾乎準確的匹配” blast 檢索（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。
一經鑒定，糖蛋白應進行以下兩點鑒別：① 它們是被分泌出來的，或其有一個潛在的信號肽嗎？② 它們至少擁有一個潛在的 N-糖基化位點嗎？一個蛋白質中的糖基化位點可通過與 Prosite 數據庫（http : //npsa- pbil. ibcp . fr /cgibin / npsa _ autom at, p i ? page = npsa _ prosite , html 或 http：// www . expasy . org /tools /scanprosite / ) 比對確定。
2. O-位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白的鑒定
鑒定 O-GlcNAc 糖蛋白質組需要麥胚凝集素（WGA) 親和層析的糖蛋白純化。之前的實驗表明 WGA 既可以結合 O-GlcNAc 糖蛋白也可以結合帶 N-糖苷的蛋白質[ 28] 。所以必須預先去除 N-糖苷，才能用親和層析柱選擇性地純化 O 位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白。這個去糖基化過程可通過能去除高甘露糖型和復合型 N-糖苷的肽 N-糖苷酶 F 來實現。但是如前所述，由于與鄰近 N-糖苷中心 GlcNAc 連接的 α-1-3 巖藻糖的存在，肽 N-糖苷酶 F 對植物復合型糖苷的作用很有限 [ 見 25. 3. 2 節 3. 2 ]。為了克服這個不利因素，要讓植物材料保持對 PNGaseF 敏感的高甘露糖型糖苷形式。本實驗方法是我們實驗室開發的用于將突變體的細胞培養物的 N-糖苷轉變為 Man5GlcNAc2 結構 [29] 。這個實驗方法應該適用于其他的植物材料，實現高甘露糖型 N-糖苷的糖基化。
( 1 ) 用神奇濾布過濾 150 ml 細胞培養物，然后將細胞培養物懸浮在 150 ml 0.5 mol/L NaCl 溶液中，4°C 攪拌 30 min 溶解以離子鍵結合細胞壁上的蛋白質（見注釋 16 和注釋 17)。
( 2 ) 用神奇濾布再次過濾細胞培養物。棄上清，在含 150 mmol/L KCl、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT 和蛋白酶抑制劑的 30 ml 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8 ( WGA 緩沖液）中研磨細胞培養物。
( 3 ) 4°C 下萃取物經 5500 g 離心 15 min，接著 25000 g 離心 30 min 后，棄去不溶物，分裝到 5 ml 管中。
( 4 ) 用 Centricon 離心超濾管（Amicon Bioseparation YM-10 ) 將 5 ml 的組分濃縮到 0.5 ml。
( 5 ) 濃縮后，加 SDS 到樣品中使其含有 0.1% SDS，100°C 加熱 5 min 變性處理糖蛋白。再加入 NonidetP40 使其終濃度為 0.5% ( 見注釋 12)。蛋白質處理變性后，加入 PNGaseF ( 5 U )，37°C 攪動溫育 24 h 進行蛋白質去糖基化反應。這一步驟中，只有 N-糖苷被消除掉。
( 6 ) 用 WGA 緩沖液將去糖基化樣品稀釋 20 倍，將其與 100 μl WGA-瓊脂糖混合，4°C 旋轉振蕩 4 h。用柱體積 20 倍的 WGA 緩沖液沖洗樹脂去除未結合在柱子上的蛋白質。
( 7 ) 為了洗脫結合在柱子上的蛋白質，將樹脂與 5~10 倍體積的含 0.5 mol/L GlcNAc 的 WGA 緩沖液在 4°C 混 合 30 min ( 見注釋 18)。收集洗脫液， 重復相同的洗脫處理一次。合并這兩次洗脫液，這個糖蛋白組分只含有 O-位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白質。
( 8 ) 加入三氯乙酸達到終濃度為 12.5%，4°C 過夜沉淀糖蛋白。10000 g 離心 15 min 沉淀蛋白質，用丙酮/水 [ 9 : 1 ( V/V ) ] 溶液洗滌蛋白沉淀 3 次，將蛋白質沉淀物懸浮在一種適當的緩沖液中供 1D 電泳備用。
( 9 ) 用 1D SDS-PAGE 凝膠電泳分離 O-位 N-乙酰葡糖胺糖基化蛋白質。經考馬斯亮藍染色后，收集膠內的所有可見條帶，經胰蛋白酶消化后，用 MALDI-TOF 或 LCMS/MS 鑒定蛋白質。
3.5 結論與展望
應用本章所列的實驗方法可獲得一個植物糖蛋白的糖苷及其組成單元、連接方式的功能。事實上，相同的寡糖序列連接到不同的糖蛋白上，或出現在植物體內不同的位置，亦或出現在植物生活周期的不同時間，都可能表現出不同的功能。因此，新興的糖蛋白質組學研究正，為了解 N-糖苷和 O-糖苷的作用，開劈一條新的途徑。縮短這一領域的差距將拓展我們對于植物生理學的認識，也為生物化學和醫學提供了更加廣闊的前景。