| 實驗步驟 | 一、轉基因插入位點的數目
第一代（ T0）轉基因植株外源基因的插入位點數目，一般都是通過遺傳方法進行鑒定。雖然遺傳分析可以在任何世代進行，但是一般選擇轉基因植株自交，或與野生型測交后得到的第二代（T1 ) 進行 。對代轉基因植株，統計目的基因表達與不表達的個體，可以獲得表型的分離比； 而對 T1 代轉基因植株，統計含與不含目的基因的個體，則可以得到群體基因型的分離比。在估測轉基因插入數目時，經常會采用前一種方法。但是，通過表型鑒定獲得的結果，經常會低于實際情況； 通過基因型鑒定所獲得的結果，則可以準確判定轉基因的插入數目。對 T0 代及其子代分析結果的比較，同樣也可以提供轉基因插入位點數的信息。最近幾年，精確評估轉基因插入數目，對發展 “基因清除”技術起了重要作用，這一技術主要是通過多個 T-DNA 區共轉化，獲得不含任何選擇性標記基因的轉基因植株。轉基因植株中外源基因的插入位點數與外源基因的拷貝數并非完全一致的，因為在同一插入位點有可能會含有多個拷貝，也有可能是以單拷貝的形式插入多個不同的位點。
1. 轉基因表型的分離
T0 代轉基因植株自交或雜交可以獲得 T1 代，用代植株可以評價外源基因的表達情況。轉入植物基因組的任何外源基因都可以用乃代植株的表型來分析，篩選 T。代轉基因植株的選擇性標記基因，也常應用于鑒定 T1 代轉基因植株外源基因的表達。若目標基因的表型容易觀測的話，同樣也可以用于幾代轉基因植株的表型分析，如通過碘染試驗可以方便地觀測與植物淀粉合成相關基因的表型。卡那霉素和潮霉素等抗生素，也可以分別用于鑒定轉基因后代中含有卡那霉素基因和潮霉素基因等相關抗性基因的陽性植株（見注 1) 。另外，通過將草丁膦、磺酰脲或草甘膦等除草劑噴灑幼苗或涂葉，也可以快速地鑒定出含有 BAR、ALS 或 EPSP 等功能基因的轉基因植株。而 β-葡萄糖醛酸酶基因、LUC 和綠色熒光蛋白基因等報告基因通常用于檢測乃代植株的外源基因表達。無損傷表型鑒定，如觀測綠色熒光蛋白基因或 LUC 的表達，優于有損傷表型鑒定，如葡萄糖醛酸酶基因染色或抗性檢測，因為前者可用于外源基因未表達的代植株的后續分子檢測。
在事件 1 和事件 2 中，凡代轉基因植株由 T。代植株自交獲得，其 β-葡萄糖醛酸酶基因活性主要通過胚乳、葉片和根的組織化學染色方法測定。
( 1 ) 胚乳染色時，種子先用 70% 的乙醇殺菌 30s，然后用 50% 的飽和次氯酸鈉溶液浸洗 15 min，再用無菌去離子水洗三次，第三次漂洗后浸數小時。在超凈工作臺上用滅過菌的解剖刀將處理好的種子切成兩半，含胚的一半種子在 MS 培養基上獲得乃代幼苗，另外一半則用來 β-葡萄糖醛酸酶（GUS) 染色。經常人們會將胚乳和胚的表型放在一起進行比較，因為它們的基因型雖然相同，但是基因組倍性不同。
( 2 ) 對于根和葉的染色，則沒有必要對種子進行消毒；當然種子也可以先在 70% 的乙醇中洗 30s，然后用無菌的去離子水洗三次。對于一些物種，如小麥和大麥，先將種子置于濕潤的濾紙上 5℃ 暗培養 2~ 4 天，接著在 20~25℃ 的暗環境下萌發 5 天，然后在同樣溫度下每天 16 h 光照培養，5~7 天后收集根和葉片。這一方法優于胚乳染色，因為有些物種的種子（如小麥和大麥）對次氯酸鈉非常敏感。
( 3 ) 根據樣品的體積大小，分別將它們浸沒在加有 β-葡萄糖醛酸酶反應液的 96 孔、24 孔或 6 孔板上。
( 4 ) 樣品放在打開的平板上抽真空（71 mm 萊柱）10~15 min，37℃ 搖床上反應過夜。
( 5 ) 第二天，觀察 β-葡萄糖醛酸酶染色后的樣品。圖 13. 1 是事例 2 中 T1代轉基因種子胚乳染色完成后所得的結果。
( 6 ) 轉基因插入位點的估測：根據 T1 代轉基因植株 β-葡萄糖醛酸酶活性的觀測結果可以得出一個分離比。根據觀測值與單基因孟德爾遺傳理論值（表 13. 1 ) 的卡方分析結果，可以判定單個基因的插入位點數（表 13.2)。在事例 2 中，幾代轉基因植株中，83 個單株具有 β-葡萄糖醛酸酶（GUS) 活性，而 17 個單株沒有（ 圖 13.1 ），這一結果表明轉基因插入位點應該是一個。盡管許多文獻上均采用此種分析方法，但值得注意的是，這一方法得出的結果只是對轉基因插入位點的一種估測 （ 見注2)。同樣是事例 2 , 進一步的分子檢測結果 （見 3.1 節中 “基于基因型的遺傳分析”）卻表明，事實上該次外源基因的獨立的插入位點應該是 2 個，而不是 1 個 ，因此根據表型得出的結果是不準確的。所以，真正的遺傳鑒定應該是基于對轉基因后代基因型而并非是表型的調查結果分析所獲得的。
2. 基于基因型的遺傳分析
表 13. 1 和表 13. 3 分別列出了 1 個或 2 個基因插入到 1 個、2 個、3 個或 4 個位點時，自交一代后的子代分離群體中，按照孟德爾遺傳規律分離的理論比值。乃代植株為研究對象，采用的分析方法為 PCR 檢測或者點雜交等分子檢測方法。由于采用分子手段對幾代植株的基因型鑒定比表型鑒定更為昂貴和費工（見 3 .1 節 “轉基因表型的分離”），因此，基于基因型的遺傳分析方法一般很少采用，盡管基于表型的分析方法有種種局限 （見注2) 。當然，可能的情況下最好將兩種方法結合在一起進行分析。下面我們將結合事例2 ，介紹此種分析方法的具體操作流程：
( 1 ) 轉基因植株的培育和表型鑒定分離結果的統計按照3. 1 節中轉基因表型的分離中步驟 2~5 進行。保證結果準確性的重要一步是，乃代植株不要選擇以使所有植株存活，并可以用于后續的實驗分析。因為抗生素或除草劑的篩選會殺死轉基因沉默的個體，從而導致遺傳分析的結果發生偏差（見注 2 ) 。在事例2 中，具有明顯 β-葡萄糖醛酸酶活性的 83 粒 T1 代種子（圖 13. 1) 應該是含有 β-葡萄糖醛酸酶基因的，因此無需進行進一步的分析。而 17 個不具有 β-葡萄糖醛酸酶活性的幾代植株則應該利用分子檢測手段作進一步的鑒定，以明確它們是因為 β-葡萄糖醛酸酶基因的沉默，還是確實不含有 β-葡萄糖醛酸酶基因而沒有表現出 β-葡萄糖醛酸酶活性。
( 2 ) 收集 17 個不具有 β-葡萄糖醛酸酶活性的代植株的葉片樣品，以及陰性對照（野生型植株）和經 PCR 檢測的陽性對照樣品，樣品的長度應該與 1.5 ml 的微型離心管匹配。
( 3 ) 按照產品的使用說明用 DNA 提取試劑盒抽取葉片樣品的基因組 DNA。
( 4 ) PCR 反應中應加入的 DNA 模板量根據各物種的基因組大小而定，25 μl PCR 反應體系中水稻基因組 DNA 的加入量通常為 25 ng，而大麥或者小麥則為 100~150 ng。
( 5 ) 每個 PCR 反應體系包括植物基因組 DNA，1x 的反應緩沖液（含 2.5 mmol/L MgCl2) ，250 μmol/L dNTP，正、反引物各 0.4 μmol/L ( 如根據 β-葡萄糖醛酸酶基因設計），2 U Taq DNA 聚合酶。
( 6 ) PCR 的反應程序：DNA 樣品先 95°C 變性 1 min；接著是 95℃ 變性 30s、60°C 退火 30s、72°C 延伸 1 min，共 30 個循環；循環結束后，72℃ 最后延伸 10 min。
( 7 ) PCR 反應產物（5~10 μl）用 1%~1.2% (m/V) 含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠進行電泳分析（每 100 ml 凝膠加入 5 μl 溴化乙錠，瓊脂糖凝膠用 0.5X TBE 緩沖液加熱溶解），電泳時電壓為 80~100 V，時間約為 20 min。紫外燈下觀察（圖 13. 2) 到 17 個代檢測樣品中有 7 個單株含有葡萄糖醛酸酶基因卻沒有 β-葡萄糖醛酸酶活性（ 即 β-葡萄糖醛酸酶基因被沉默了）。
( 8 ) 可以利用植物本體單拷貝看家基因或者 RFLP 探針的引物重復步驟 5~7 對 DNA 樣品進行質量鑒定，以確保它們能夠成功地進行 PCR 擴增。通過對看家基因的擴增分析，結果表明從事例 2 中獲得的 10 個樣品可以進行 PCR 擴增（圖 13. 2) 。
( 9 ) 計算轉基因插入位點數：利用孟德爾遺傳規律的理論值（表 13. 1 ) 可以對所獲得的觀察值進行卡方檢測。事例 2 中，90 個 T1 代單株含有 β-葡萄糖醛酸酶基因，而 10 個單株不含，根據卡方檢測結果我們可以看出植物基因組中轉基因的插入位點應該是兩個，它們可以獨立地自由分離（表 13.2) 。
3. 跨世代 Southern 分析
Southern 分析一般用于鑒定各個轉基因插入位點的排列形式（見 3 .2 節中“ Southern分析” ）。當然，通過對不同世代轉基因植株雜交檢測結果的比較，它也可以用于轉基因插入位點數的測定。例如，根 據 T。代和自交所得到凡代植株的 Southern 分析結果就可以判定外源基因的插入位點數。以事例 2 為例，下面具體介紹這種方法。
( 1 ) 樣品的 DNA 可以按照 DNA 提取試劑盒推薦的方法從植株葉片中抽提（見注3 ) ，DNA 的濃度根據所提樣品在波長為 260 nm 的吸光值推算。樣品提好后可以放在 4℃ 短時保存，也可以長期存儲在 -20℃ 中（見注4 ) 。
( 2 ) 用于 Southern 分析的 DNA 量主要根據每個作物基因組的大小而定，一般水稻為 5 μg，大麥和小麥則需要 20 μg。DNA 樣品消化時，反應體積為 50~80 μl，限制性內切核酸酶的用量為 10~15 U/μg DNA ( 見注5 ) 。另外，進行樣品 DNA 消化時應同時消化陰性對照（即野生型）和陽性對照（如已經過 Southern 分析鑒定為陽性的單株）的 DNA。
( 3 ) 酶切消化后的反應液先用真空離心機濃縮到約 30 μl 的體積，然后加入到濃度為 0.8% 的瓊脂糖凝膠中（用 1x 的 TBE 熔化），在 40 V 的電壓下電泳過夜。同時凝膠中還應該加入1 或 2 種標記 （如 600 ng 的用 Pst I 或者 HindⅢ 酶切后的 λ 噬菌體 DNA 產物）。另外，在空白點樣孔上還應加入限制酶的反應緩沖液以避免電泳時有可能發生的帶偏差。
( 4 ) 電泳完畢后，用溴化乙錠染好的凝膠在紫外燈下拍下照片，以便于確定 DNA 的酶切消化程度和各個樣品點樣時的均一度，同時記錄標記的各個條帶在凝膠中的位置。
( 5 ) 凝膠先用 0.25 mol/L HCl 溶液（緩慢搖動）洗 15 min 后再用水沖洗，然后在 0.4 mol/L NaOH 溶液中變性 15 min 后，將 DNA 樣品過夜印跡到尼龍膜上。轉印完成后 ，將尼龍膜放入 2X SSC 溶液中洗 2 min，再用薄膜包好放在 5℃ 下短期保存或者 -20℃ 下長期保存。
( 6 ) 尼龍膜在 65°C 下先放入雜交液中預雜交 2~5 h , 雜交時要保持緩慢的搖動。50 ml 雜交液中含有 2 ml 5x HSB、1 ml Denhardt 反應液 II 和 1 ml 載體 DNA ( 在沸水中變性 7 min)。
( 7 ) 雜交使用的探針（長度大約為 500 bp) 可以通過對轉化用質粒進行酶切凝膠回收（用 QIAquick Gel Extraction kit 試劑盒）后獲得，也可以通過 PCR 擴增后再用 PCR 回收試劑盒（ 即 QIAquickPCR Purification kit) 回收后獲得，具體操作根據產品的使用說明。25 ng ( 體積 15 μl) 的探針沸水浴 7 min 后在冰上放置 5 min，然后加入 5 μl OLB、2 μl BSA、2 μl DNA Polymerase I Klenow 片段（5 U/μl) 和 2 μl 32P dCTP 在 37℃ 下反應 2 h 以完成探針的標記。標記好的探針用 2.6 μl 3 mol/L NaOH 變性 5 min，然后加入到預雜交液中。雜交膜在預雜交液中 65℃ 緩慢振蕩過夜。
( 8 ) 尼龍膜先用 500 ml 2x SSC 和 1% SDS 溶液洗兩次，每次 15 min，然后再用 500 ml 0.2 X SSC 和 1% SDS 溶液洗兩次，每次也是 15 min。洗好后，尼龍膜用薄膜包好。
( 9 ) 估測轉基因插入的位點數：處理好的尼龍膜可以用膠片放射自顯影分析或者磷屏分析。例如，在事例 2 中通過比較 T0和 T1 代植株的 Southern 分析結果可以得出轉基因插入位點為兩個（圖 13.3 ) 。 盡管 Southern 分析方法可以精確地鑒定出轉基因插入位點的數目，但是也有其局限性，具體請見注6 。此外，這種分析方法也可以用來檢測后代中轉基因位點結構的穩定性。當多個 DNA 片段或者載體一起轉化時，Southern 分析也應該用可以公用的單個探針或者多個特異性的探針混合在一起進行雜交（即每個片段或載體一個探針）。
二、每個轉基因插入位點的構型
當只有一個外源基因插入位點時，通過對 T。代植株的分子鑒定即可以了解插入位點外源基因的拷貝數和排列方式。當發現轉基因植株中有多個插入位點時（ 根據 3.1節中的方法鑒定），則要對每個插入位點逐個進行分析，其主要是采用分析分離群體的單株，或者分析各個位點的純合系的方法。
1. Southern 分析
在鑒定轉基因插入位點的構型時，Southern 分析是最常用的方法。通過酶切和能覆蓋用于轉化的全長 DNA 序列 （包括載體的骨架序列）的探針的聯合分析，可以重構出每個插入位點的全部結構。首先要做的是估測每個插入位點的外源基因拷貝數（保持原樣或者重排）。根據插入位點的復雜性采用不同的方法進行分析。下面分別介紹含有一個或少數幾個的拷貝數的簡單轉基因插入位點，以及含有大量拷貝數的復雜轉基因插入位點的具體分析方法。
( 1 ) DNA 的提取、膜的制備和雜交具體可以參考 3.1 節步驟 1~ 8。植物基因組 DNA —般采用單酶切，本例中用的是質粒中的 Xbal 酶切位點。使用的探針必須可以與酶切位點 5 ' ( 以潮霉素基因為例）或者 3 ' ( 以 β-葡萄糖醛酸酶基因為例）端的外源基因序列特異性雜交（見注 8) 。
( 2 ) 用放射自顯影儀或者感光成像儀對膜進行初步分析，根據所得的結果一般就可以對每個插入位點的復雜性進行初步的評估。
① 簡單插入位點的分析
經過酶切和探針雜交后，Southern 分析所得結果產生最多 4 條亮度相近的雜交條帶 ( 如事例 2 位點 1 和位點2) 。
a. 用于 Southern 分析（3.1 節步驟 1~8 ) 的限制性內切核酸酶（ 見注 9 ) 和探針可以參照表13. 4 的常用方法。通過 Southern 分析不僅可以對轉基因位點區域內的序列進行研究，也可以對兩邊近鄰序列進行分析。如果需要更為精確的結果，推薦最好還是用多種不同的酶和探針進行多次分析。例如，在事例 2 的位點1 中 （ 圖 13.4)，應該再用 Hind Ⅲ 作為限制性內切核酸酶酶切，該酶切位點位于 β- 葡萄糖醛酸酶基因表達區的側邊，用 β- 葡萄糖醛酸酶基因啟動子或終止子的序列作為探針進行雜交分析，因為在該插入位點上可能存在多拷貝和重排的外源基因。另外，利用與載體抗性基因序列特異性結合的探針還可以檢測轉基因個體中是否含有載體序列。
b. 事例 2 位點 1 的結構鑒定：經過 Xba I 和 HindⅢ 酶切及 β-葡萄糖醛酸酶基因探針雜交后，膜上出現的多個條帶說明該插入位點可能含有多拷貝的 β-葡萄糖醛酸酶基因，一個完整和一個可能缺失的。但是，潮霉素基因和 NPTI 基因探針的雜交條帶卻只有一條，這個結果表明載體序列已經轉染和整合到了植物基因組上。這主要是因為 T-DNA 的左邊界的無效識別/剪切，導致對 T-DNA 序列的 “通讀”引起的（見注 10)。根據雜交條帶的大小，則可以推測出插入位點序列形成的結構（圖 13.4)。
c. 事例 2 位點 2 的結構鑒定：用 β- 葡萄糖醛酸酶基因和潮霉素基因的探針進行雜交時只有一條帶。用的探針雜交時沒有信號，表明載體主骨架沒有整合到植物基因組上。根據雜交條帶的大小可以推測出該位點序列所形成的結構（圖 13.5)。
② 復雜插入位點的分析
通過多種不同的限制性內切核酸酶和探針對事例 1 進行 Southern 分析，發現雜交結果中有 4 條或以上信號強度不同的雜交帶（圖 13. 6) 。對于這種情況，雜交結果一般不太可靠 [ 17 ] , 單獨的結果也不能用來精確地推測插入位點的構型和外源基因的拷貝數 ( 見注 11)。但是通過對雜交信號的光密度分析，還是可以估測轉基因以及外源基因完整的表達單位（即啟動子+基因+終止子）的拷貝數。用轉基因載體上所沒有的酶切位點進行 Southern 分析時，通過所得的結果也可以幫助了解插入位點處植物基因組序列的存在情況。
( a ) DNA 的提取可以參考3. 1 節步驟 1。必須先精確測定野生型植物基因組 DNA 濃度和作為標樣的質粒 DNA 濃度，以便于后續的光密度分析（見注 12)。
( b ) DNA 的消化可以參考3.1 步驟 2 。與 1 、 2 、5 、10、 20 、40 和 80 拷貝外源基因相當的標樣分別加入 5 μg 野生型 DNA 中 （ 見注 13 ) , 另外推薦在每張膜上加入陽性對照 （ 見注 14)。
( c ) Southern 分析主要參考3. 1 節步驟 3~8，利用 β- 葡萄糖醛酸酶基因表達區相鄰的 Hind Ⅲ 酶切位點，或者是 Pac I 、Nhe I 、Bst X I 、Apa I 和 Kpn I 等轉化載體上無酶切位點的酶，降解植物基因組 DNA。分析時需要4 種不同的探針：1 個單拷貝的 RFLP 探針；3 個分別可以與 β- 葡萄糖醛酸酶基因、潮霉素基因和 NPTI 基因特異性結合的探針。RFLP 探針是為了保證各個樣品所加樣量的均一性（見注 14)。經過 Hind Ⅲ 酶切后的雜交，一 些條帶的大小和質粒 DNA 酶切產生的（CfAS) 的表達區（2.9 kb) 相似，而其他的更大或小一些的條帶可能是由 DNA 重排所致。利用 Spe I 和 HPT 基因探針的 Southern 分析的結果與上面類似（ 圖 13.6) 。而利用載體無酶切位點的 Apa l 進行酶切時，β- 葡萄糖醛酸酶基因探針雜交出了兩條帶，由此表明該插入位點內可能還含有部分植物基因組序列。事例 1 中存在著大量拷貝的 NPT I 基因，也證實了載體序列的整入( 因為基因槍法使用的是完整的載體質粒）。然而根據這些信息仍然無法得出事例 1 中轉基因插入位點的構型。
( d ) 事例 1 中轉基因拷貝數的鑒定：雜交膜上除去背景后所有雜交信號的強度都可以用光密度計（Bio-Rad 690 ) 或感光成像儀等儀器進行定量分析。根據信號的強度和基因拷貝數的相關性，通過回歸分析可以重建標準曲線。依照標準曲線和酶-探針聯合分析的結果，則可以推測出每個樣品外源基因的拷貝數（ 見注 15 ) 。Hind Ⅲ、Spe l 和 Xba I 酶切后雜交的信號表明轉基因事例 1 中含有 36 個拷貝的 β- 葡萄糖醛酸酶基因和 14 個拷貝的潮霉素基因（圖 13. 6 ) 。
2. 其他方法
通過 Southern 雜交分析，對每個轉基因插入位點的總體結構有了一個大致的了解。但是要想完全掌握轉基因插入位點的所有信息，則需要對插入區和近鄰的基因組序列進行測序分析 [18, 19 ] ，有時對基因組 DNA 的序列分析更為重要。本章中，對此方法不做詳細介紹，但是，擬南芥 [ 20 , 2 1 ] 和 水 稻 [ 22 ] 等模式植物的轉基因近鄰序列高通量分析方法已見諸報道。根據插入區近鄰植物基因組序列的測序結果，可以設計 PCR 引物，逐步地對整個插入區進行擴增和測序。此外，依照近鄰序列所設計的引物，還可以用于野生型基因組序列的擴增分析，從而可以鑒定出外源基因插入位點處是否存在基因組序列的丟失。同時，DNA 測序還能鑒定出轉基因時是否發生了葉綠體 DNA 和外源基因的共整合。
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