熒光基因分型篩查微小亞端粒重排實驗

樣品 DNA

PCR 引物氯化鎂溶液dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP 混合液Taq 聚合酶96孔板PCR熱循環儀瓊脂糖EB 溶液上樣緩沖液電泳緩沖液Long Ranger? 凝膠溶液尿素

水平凝膠電泳裝置紫外透射反射儀濾膜GS-400 HD ROXABI 377 自動測序儀

一、端粒衛星的 PCR 擴增

1.將引物置于冰上融化后輕輕混勻，稍離心。

2.對于每個標記物，準備 12 個反應的混合液包括：196μL 高壓蒸餾水、32.5 μL 10XPCR 緩沖液、9.75μL 氯化酶、32.5μLdNTP 混合物、正反向引物各 2uL 和 1U Taq 酶，在冰上操作和保存。

3.將上述 15uL PCR 反應混合液加到 10uL DNA 中，用鋁箔膠蓋密封 96 孔板。

4.擴增前將 96 孔板放到熱循環儀上，94°C 變性 5 min。

5.循環條件為 94°C、30s，55°C、30s 和 72°C、45s，共進行 35 個循環，最后的延伸時間為 72°C、7 min。樣品可在- 20°C 保存備用。

二、PCR 鑒定

1.凝膠電泳：取 3uL 上樣緩沖液與 5uL PCR產物混合，上樣到含有 5mg/ml EB 用 1XTBE 配制的 1.5% 瓊脂糖凝膠上。

2.使用合適的分子質量標準，在 100V 電壓下電泳 30min。

3.將電泳后凝膠移到紫外透射反射儀上觀察 DNA，確保微衛星的正確擴增。

三、擴增產物的凝膠分析

1.按照 ABI 自動測序儀手冊所列方法，把玻璃板和隔板放到指定的盒子里。

2.將 3 mL LongRanger 凝膠溶液和 3 mL10X TBE 混勻，加10.8 g 尿素，溶解后加去離子水至 30 mL，用 0.45um 濾膜過濾。

3.加入 150μL ,10% 的 APS 和 21μLTEMED 后倒膠，使凝膠聚合 lh。

4.按說明書將凝膠盒裝進測序儀。

5.按表 2 所示在 PCR 擴增后將等量的每種擴增產物混合在一起（見注釋 3)。

6.新鮮配制上樣混合液：0.5μLGS-400 HDROX、1xL 上樣緩沖液和 5 ml 去離子甲酰胺。

7.將 2μLPCR 產物混合溶液與 3pL 上樣混合液混勻。

8.90°C 變性 3 min 后，快速放到冰上。

9.將樣點人膠孔中。

10.應用運行 GS36D2400 模塊搜集數據。

11.按產品手冊說明用 GeneScan 軟件進行數據分析。

12.用 GenoTyper 軟件確定等位基因的大小。

注釋

1.研究表明：細胞遺傳學難以辨認的非平衡易位是導致 CT 地中海貧血智力障礙綜合征（ATR-16[16])、Wolf-Hirchhorn 綜合征 [17]、Miller-Diecker 綜合征 [18] 和貓叫綜合征（cri-du-chatsyndrome)[19] 智力障礙的原因。

2.用此方法可能會出現的問題是如何確定端粒重排導致的表型。當有一個以上的受累子代、端粒重排與智力障礙共分離時這種關系是明確的。在缺乏智力障礙家族史的條件下，當重排涉及以前智力障礙病例缺失的區域，或者當缺失片段非常大時，就可獲得端粒重排的生物學效應證據。在其他病例中，確定小端粒重排的致病性可能更加艱難。

3.為了使獲得的所有位點峰高一致，可能需要調整每次混合的比率。