熒光原位雜交在非整倍體植入前診斷中的應用實驗

冰乙酸甲醇牛血清白蛋白檸檬酸鈉低滲液胃蛋白酶HCl福爾馬林SSC甲醛緩沖液

顯微載玻片培養瓶巴斯德吸管微量移液器架金剛石筆洗耳球解剖顯微鏡倒置顯微鏡小型噴燈毛細吸管恒溫箱微型離心機漩渦振蕩器離心管

一、用于 FISH 分析的 PB1、PB2 和卵裂球（從卵母細胞和胚胎分離后）的制備

PBl、PB2 標本的制備

1.在 50 mL 培養瓶準備新鮮固定液（甲醇：冰乙酸=3:1)，在冰柜中保存備用。

2.將毛細吸管在小型噴燈的火焰上拉出內徑約 50pm 的尖，內徑太大可能會丟失極體。

3.加幾滴固定液再處理預先處理過的玻片以清除可能存在的油脂或灰塵，用無塵紙吸干。

4.用巴斯德吸管吸少許 HPLC 純水加到可懸掛液滴的載玻片上。

5.從卵母細胞或受精卵成功取出極體后，可以用相差顯微鏡（10X、20X 物鏡）來觀察極體，極體存在于顯微操作儀上的平皿里的 20uL 培養液滴里（液滴上面用礦物油覆蓋)[6]。

6.極體定位好后，用拉好的毛細吸管吸取少量水，以確定液體進出吸管的通暢。

7.在吸入少量水后，將極體輕輕吸入毛細吸管移向有水的可懸掛液滴載玻片上，從毛細吸管中輕輕吹出釋放極體，直到在玻片中心的圓圈中看到極體。勿讓極體固定和貼到可懸掛液滴載玻片的玻璃表面。

8.在水中漂洗片刻后，用毛細吸管重新吸入極體。極體周圍的油通常可以被水洗掉。將極體移向一張干凈的載玻片，輕輕吹出含極體的水滴將極體釋放。

9.當水分部分蒸發后，極體開始漲大，變扁平貼到玻片表面。在水分完全蒸發完之前用同一毛細吸管滴一滴固定液在極體上，使染色質分散開。

10.在固定液完全干掉前，再滴一滴固定液固定，必要時可重復幾次，直到細胞質完全溶解，仔細注意觀察此過程，應盡量將細胞質去除干凈（見注釋 1 和 5)。

11.用金剛石筆在染色質周圍畫圈定位，注意不能太重，以免玻璃碎屑的影響，再用力在圓圈周圍的玻片背面畫另一圓圈，以便輕易找到圓圈和分析時定位染色質的位置。

12.將玻片做好標記，包括患者姓名、卵母細胞編號以及合適的信息，如染色質塊數目。

13.再加數滴固定液到玻片上，用洗耳球吹干。

14.玻片可在室溫放置過夜后或立即進行雜交，如果立即雜交，則推薦進行預處理。可在移植胚胎比較合理的時間范圍內得到很好的結果。

15.用不褪色標記筆在玻片的背面畫出極體染色體質所在，以便確定加探針的位置。

卵裂球標本的準備

1.在 50 mL 培養瓶準備新鮮固定液（甲醇：冰乙酸=3:1)，在冰柜中保存備用。

2.在一 35 mmX10mm 的有蓋培養皿底部刻一圓圈便于在此區域找卵裂球，在皿內加 3 mL 低滲液。

3.將 25~50uL 毛細吸管在小型噴燈的火焰上拉出內徑約 70um 的尖毛細吸管。

4.在毛細吸管吸入少量的低滲液。

5.在解剖顯微鏡下定位在培養液微滴內的卵裂球，再次確認制成的毛細吸管的內徑比卵裂球大，可以用來吸取卵裂球；然后用它輕輕地吸取卵裂球，將卵裂球移到低滲液皿內。

6.低滲 3~5 min 后，將卵裂球吸到管內移到有少許低滲液的玻片上。

7.在倒置顯微鏡下持續觀察卵裂球直到幾乎全干。在低滲液全干形成結晶之前在卵裂球上滴上一滴固定液。持續觀察細胞，在全干前滴一滴新固定液。如此重復幾次，直到細胞質裂解，留下細胞核。細胞質去除是否完全直接影響雜交 (見注釋 1)。

8.用金剛石筆標記卵裂球的位置以便于雜交后的定位。

9.在玻片的磨砂端注明合適的信息，再滴數滴固定液，用洗耳球吹干。

10.玻片可以進行預處理。在加探針前，用不褪色標記筆在玻片的背面標記卵裂球核的確切位置，以確定加探針的區域。

二、標本預處理

1.在 37℃的 2 X SSC (pH為7.0~7.5) 中洗 10 min。

2.在 1% 甲醛中室溫條件下固定 5 min。

3.室溫條件下在 1xPBS(pH 為 7.0~7.5) 中洗 5 min。

4.在 37℃的溶于 0.01mol/LHCl 的胃蛋白酶溶液中處理 5 min。

5.室溫條件下在 1xPBS(pH 為 7.0~7.5) 中洗 5 min。

6.取出玻片甩掉液體，將背面殘留的 PBS 擦去。

7.室溫條件下將玻片在系列乙醇（70%、85% 和 100%) 中進行脫水各 1min，氣干以備雜交。

8.對需要重復雜交的標本，在預處理前去掉蓋玻片，將玻片置于甲醇溶液中 5 min，確保染色質固定于玻片上。

三、探針制備、雜交及洗脫

探針混合物

1.三色探針混合：先將盛探針的三個離心管離心，然后用渦旋振蕩器振蕩理想的探針及 LSI 探針雜交緩沖液 10s。配 10juL 的探針雜交液，也就是 13、18 和 21 號染色體探針各取 lfxL，加到盛有 7；xLLSI 探針雜交緩沖液的微量離心管中，振蕩混勾、離心。

2.僅一個染色體的探針，則探針混液組成為 IyL 探針、2pLHPLC 級純水和 7pL 雜交緩沖液。對于 CEPX 和 CEPY 探針混合物，將探針和 CEP 雜交緩沖液振蕩并離心。10/xLCEPX 和 CEPY 探針混合物工作液組成：I1^LCEPX. 和 CEPY 的探針混合物、2 斗 HPLC 級純水和 CEP 雜交緩沖液。

3.MdtiVysion 的 5 色探針混合物是可以直接使用。用前先離心，振蕩混勻。所有的探針混合物工作液都可以-20℃保存幾個月（在廠家提供的有效期內)。

雜交程序

1.雜交前，先用金剛石筆將 22 mmx30 mm 的蓋玻片切成 8 mmx8 mm 的小塊，放在有蓋的玻璃培養皿內備用。

2.封口膜剪成約 22 mmx22 mm 大小，放在皿內備用。

3.準備雜交濕盒：用消毒過的水浸濕紙巾后放入一玻璃皿內，再放一玻片架，加蓋后放于 37℃ 溫箱預溫備用。

4.從-20℃取出要雜交的探針混合物工作液，離心 10s 后振蕩混勻。

5.用微量移液器將 2uL 探針混合物工作液加于玻片上標記好的染色質區域后，迅速用鑷子將 8 mmx8 mm 蓋玻片蓋上，注意不要有氣泡而影響雜交。若出現氣泡，用鑷子輕壓蓋玻片將氣泡趕出。

6.用橡皮泥或封口膜將蓋玻片封口。用封口膜時要注意壓下蓋片周圍，以確保封口膜都粘在玻片上（見注釋 2)。

7.將玻片置于 69℃ 的玻片電熱板上 8 min，使探針和標本 DNA 同時變性。

然后將玻片標本迅速移到 37℃ 溫箱預熱的濕盒中進行雜交（見注釋 3 和 4)。

洗脫步驟

以下是我們實驗室常用的兩種洗脫步驟，無需甲酰胺且省時。

快速洗脫程序 I

該洗脫程序適合 1~3 種顏色的探針混合物和 MdtiVysionPGT(13、18、21、X 和 Y 染色體)。

1.將裝有 0.4xSSC/0.3%NP-40(pH7.4) 溶液的染色缸放入 73℃水浴中預熱，在對標本洗脫之前用校準過的溫度計檢查缸內的溫度，溶液溫度應為 (73±1)℃。

2.準備一缸 2xSSC/0.l%NP-40(pH7.4) 溶液，放置于室溫下備用。

3.揭掉蓋玻片后立即放入 0.4xSSC/0.3%NP-40(pH7.4) 中，當所有的標本（同一染缸最多放 4 張玻片）放入后洗脫 5 min。

4.將標本移入裝有 2XSSC/0.1%NP-40(pH7.4) 液的染色缸中室溫洗脫 1min。

5. 從洗脫液中取出標本于 HPLC 級純水中浸泡一下，將標本垂直立于暗處 (如抽屜中）紙巾上晾干。

快速洗脫程序 II

該洗脫程序適用于 MultiVysionPB(極體）探針組合，包括 13、16、18、21 和 22 號染色體探針。

1.將裝有 0.7XSSC/0.3%NP-40(pH7.4) 溶液的染色缸放入 73℃ 水浴中預熱，在對標本洗脫之前用校準過的溫度計檢查缸內的溫度，溶液溫度應為（73±1)℃。

2.準備一缸 2XSSC/0.1%NP-40(pH7.4) 溶液，置于室溫條件下備用。

3.揭掉蓋玻片后立即放人 0.7XSSC/0.3%NP-40(pH7.4) 中，當所有的標本（同一染缸最多放 4 張玻片）放入后洗脫 7 min。

4.將標本移入裝有 2XSSC/0.1%NP-40(pH7.4) 溶液的染色缸中室溫洗脫 1min。

5. 從洗脫液中取出標本于 HPLC 級純水中浸泡一下，將標本垂直立于暗處 (如抽屜中）. 紙巾上晾干。

DAPI 復染

1.每一玻片加 10juLDAPI/抗淬滅混合液于雜交區，蓋上 22 mmX30 mm 的蓋玻片。

2.用紙巾或吸墨紙使溶液均勻分布和吸去玻片上多余的液體（對于 MultiVysion5 色探針混合物，配有不含 DAPI 的專用復染液)。

四、信號評估

1.雜交信號在 600 倍的熒光顯微鏡油鏡下觀察。由于熒光信號見光易淬滅，為減少突光衰減，所有含焚光素的液體操作，包括雜交后標本的處理步驟都應在弱光下進行。對所有不需要光線的步驟（包括雜交溫育及洗脫過程）都應避光進行（見注釋 2)。

2.熒光顯微鏡用 100W 的汞燈激發，盡管制造廠家推薦汞燈的壽命至少有 200 h，但我們發現使用 175 h 后鏡下的雜交信號變弱造成誤診。應有備用汞燈燈泡。

3.MuItiVysionPGT 的多色探針組合中，X 染色體的信號為藍色，Y 為金色，13 號染色體為紅色，18 號為淺綠色，21 號為綠色（見注釋 7 和 8)。

4.MdtiVysionPB 極體專用的多色探針組合中，13 號染色體的信號為紅色，16 號為淺綠色，18 號為紫藍色，21 號為綠色，22 號為金色（圖 1)(見注釋 7 和 8)。

5.通過與探針標記的熒光素相應的單通道濾光片觀察到信號（紅、綠、藍、金、淺綠色及 DAPI)，雙通道或三通道的濾光片只適合于鑒別非特異熒光信號或記數著絲粒探針信號常見的信號滲透，后者探針雜交于 a 衛星重復序列，信號大而亮（見注釋 7)。

6.確定信號數目時，應注意每個信號的大小和亮度，尤其是當兩個信號比較接近時。鑒別 13、21 和 22 號染色體是用位點特異性探針，其中包含要研究染色體的同源序列和未標記的封閉 DNA 抑制共同序列。與計數 16、18、X 和 Y 染色體著絲粒的探針（與大量的《衛星重復序列雜交）相比，特異序列探針信號為小圓點（見注釋 6 和 7)。

7.對于距離比較近相互搭在一起甚至相互重疊的不同染色體信號，如何與非特異雜交信號進行鑒別，建議同時用單通道和雙通道濾光片仔細觀察。在圖像上，不同顏色的信號重疊部分由于顏色組合可顯示黃色或白色（見注釋 7 和 8)。

當用三色及以上的探針組合時，強烈推薦用圖像分析系統進行分析。

8.PBl 中每條染色體含兩個染色單體，每一染色體應有兩個大小相同的信號，一般兩信號的間距應大于一個信號的直徑（圖 1 中 A、C 和 E)。但如果兩個染色單體距離近，信號可能連在一起，像一個熒光小帶（圖 IE 中所示的 PBl 中 16 號染色體信號），代表兩條染色單體（見注釋 6 和 9)。

9.PB2 中每條染色體含單個染色單體，因此每一檢測的染色體呈現一個熒光信號（圖 1 中 A、C 和 E)。

10.正常情況下，在每個卵裂球核中要研究的染色體信號為兩個單點信號 (圖 1 中 B、D 和 F)。但由于不同的細胞周期階段、染色體的濃縮及鋪散程度不同，染色體信號可顯示為雙點信號。復制后，每一條染色體的信號可顯示為距離小于一個信號直徑的成對的信號點，或者是兩個相互搭在一起的小帶，按分析標準這兩種情況都應記為一個信號（見注釋 7 和 8)。

11.如果兩信號點的大小及亮度都相等，且兩者之間的距離大于兩個信號的直徑，則計為兩個獨立的信號。但染色質髙度濃縮核的兩個獨立信號間的距離也可能小于兩個信號的直徑，必須注意考慮這種情況以免誤診。每一個核信號的大小和亮度應與同一玻片上的其他核進行比較，以區分真正的信號和非特異信號。

熒光強度弱、小或平面無焚光外觀的雜交點不在計數之列（見注釋 6 和 7)。

注釋

1.在做雜交前，必須將卵裂球、PB 和 PB2 的染色質完全暴露、無殘留的細胞質并牢固在玻片上。因此在加探針之前，極體或卵裂球標本還應進行預處理以保持形態和去掉殘留的細胞質。胞質殘留是通過核酸復性過程影響雜交的最大因素，可導致非特異熒光信號影響結果判斷，這是需要克服的重要問題。染色質暴露的不充分和胞質殘留可在雜交后顯示非特異的熒光信號，使得信號判斷困難甚至無法分析。

2.FISH 涉及的所有操作步驟（包括固定）的標準化和質控監測，對雜交信號的質量和解釋是至關重要的。為確保特異性，每一批標本都應有對照淋巴細胞標本同時進行雜交。，

3.依據所用雜交探針種類的不同，雜交時間可從 2 h(著絲粒探針或特異序列探針）到 16 h(全染色體涂染探針或亞端粒探針）不等。用 MdtiVysicm 探針組合，不用 DAPI 復染，雜交時間在 3 h 內。若雜交時間太長，探針混合物中用 aqua 標記的胎盤 DNA 會使染色質產生很強的背景。建議卵裂球的 MultiVysion 探針雜交時間不超過 2 h，極體的 MultiVysion 探針雜交時間不超過 3 h。

4.Vysis 公司的 Hybrite 雜交裝置可代替玻片電熱板和溫箱同時對核酸變性和雜交（一次最多可做 12 張玻片）。從變性（69℃、8 min) 到雜交（37℃、3~16 h) 都是程序化控制。沿玻片電熱板在每個槽中都加幾微升的水，以保證潮濕的環境，對過夜雜交尤其重要。在玻片上加探針，蓋上蓋玻片并用封口膜封片后就可以放人 Hybrite 雜交裝置。蓋上蓋子，啟動程序，不要動標本直到雜交過程結束。在啟動程序前用玻片溫度計監測如融解溫度是否準確，來確定功能的正常使用。

5.如果 PBr 固定效果不好，有胞質殘留，探針核酸可能無法接觸到固定標本的核酸造成雜交失敗。如果形成新的雜交，信號可能會很弱和（或）散成多個點，這種情況多見于過度退化的第一極體。染色質固定不足加上細胞殘留物可能導致雜交后的非特異熒光，使得信號判斷困難甚至無法分析。

6.盡管所有條件都按標準控制，但有時一個探針或多個探針的信號會較彌散甚至散成多個點，這樣的結果分析起來較復雜。這種情況通常是染色質退化所致。當信號彌散或分離時，一定要同時考慮檢測 PBl 和 PB2 的信號質量。

7.非特異雜交在兩個或以上的濾光片下都能看見，位置不變，但通常較弱。當探針熒光信號特別強時，可在其他濾光片下觀察到滲透的信號，但信號通常較弱且無立體感。一般出現這種現象的都是信號較強且彌散的 CX 衛星重復序列探針。

8.用適當的單通道或雙通道濾光片可以排除強的非特異雜交。如果卵裂球核周胞漿去除干凈而沒雜交信號，同一玻片上其他核有信號，應考慮卵裂球異常。這種情況并不少見，尤其是當核大小差異明顯或核片段化時。

9.在評價 PBl 熒光信號中，考慮到受精后的移出（如回收后 24 h)，代表每一個染色單體的信號可能進一步分開，因為染色單體隨時間延長而分離。這些預先分離的信號視為正常，信號數較易確定（見圖 IA 中 PBl 中的 22 號染色體金色信號以及圖 IE 中 PBl 中的 18 號染色體信號)。

10.用 FISH 技術對卵裂球、PB1、PB2 進行植人前非整倍體診斷具有很高的準確性和可靠性。這已通過對預期異常的全胚胎的確證研究和大約 2000 個 PGD 周期的 500 個以上臨床妊娠的隨訪性細胞遺傳學檢測結果得以驗證。