用肽適配體正向分析細胞過程實驗2

通過配對相互作用或捕獲法鑒定的肽適配體的假定靶點應當通過遺傳學測試進行驗

證，例如：

1. 用免疫沉淀法確定體內適配體的相互作用；

2. 通過上位（顯）性分析以確定適配體在與靶蛋白相同的區域發揮功能；

3. 比較由靶蛋白刪除或過表達引起的表型與由適配體造成的表型。

編碼硫氧還蛋白肽適配體的 DNA質粒 DNA酵母株

完全極限（CM） 缺失成分液體培養基和平板捕獲庫

實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」

1. 用含有與 PEG202 多接頭相容并與 LexA 編碼框整合的限制酶切位點的引物進行 PCR 擴增編碼硫氧還蛋白肽適配體的 DNA。

2. 用標準的亞克隆技術將 PCR 產物插入到 pEG202 中以構建出肽適配體誘餌。

3. 按照標準的乙酸鋰轉化法將各個肽適配體誘餌和 pSH18-34 （lacZ 報道質粒）轉入 EGY48 （Mata） 中。同時用一對照質粒（PEG202）和 pSH18-34 轉化 EGY48。

4. 在 10 cm Glu/CM-His、-Ura 平板上篩選轉化株。

對于配對相互作用分析：

5a. 將所感興趣的蛋白質的編碼區插入 PJG4-5 的多接頭處以構建該蛋白質的捕獲質粒。

6a. 按照標準的乙酸鋰轉化法將捕獲質粒和對照質粒（PJG4-5） 轉入 EGY42 （Mata） 中。在 10 cm Glu/CM-Trp 平板上篩選轉化株。

7a. 將含有肽適配體誘餌的酵母株與含有靶蛋白捕獲質粒酵母株配對并評估其相互作用。

對于相互作用阱庫捕獲法：

5b. 用基因組或 cDNA 捕獲庫轉化含有單個肽適配體和 PSH18-34 （步驟 3） 的酵母株。cDNA 和基因組捕獲庫的轉化。

6b. 相互作用阱捕獲方法篩選肽適配體的靶點。

1. 材料

編碼硫氧還蛋白肽適配體的 DNA

質粒 DNA：pEG202，pSH18-34， pJG4-5

酵母株：

EGY42 ： Mata ura3 trpl his3 leu2

EGY48 ： Mata ura3 trpl his3 3LexA-operator-leu2

2. 試劑

完全極限（CM） 缺失成分液體培養基和平板，補加 2％ Cm/V） 葡萄糖 （Glu） 或 2％ （m/V） 半乳糖和 1％ （m/V） 棉籽糖（Gal/Raf）：

Glu/CM-His， -Ura （10 cm 平板）

Glu/CM-Trp （10 cm 平板）

捕獲庫