用比較基因組雜交描述染色體結構異常實驗

抽取核型正常男性的外周血牛血清白蛋白

新鮮配制的固定液秋水仙胺PRMI胎牛血清青霉素鏈霉素L-谷氨酰胺植物血球凝集素HEPES緩沖液KClDulbecco 磷酸緩沖液胸苷溶液啟動培養基連續培養基福爾馬林固定液熒光素-2-dUTP德克薩斯紅-5-dUTP整套 dNTP2-疏基乙醇dNTP 混合物TAE溴化乙錠瓊脂糖凝膠

巴斯德吸管染色缸PureGene DNA 純化試劑盒水浴鍋

一、正常男性外周血細胞的培養

1.將核型正常男性的500?650μL新鮮全血加入10mL啟動培養基中。

2.37℃條件下培養約72h(3d)。

3.加入200mL胸苷溶液，輕輕混勻。

4.37℃培養14?18h(過夜)。

5.155g離心10min。

6.棄去上清，加入10mL 1×PBS，顛倒混勻。

7.155g離心10min。

8.棄去上清，加入10mL連續培養基，輕輕顛倒混勻。

9.37℃條件下繼續培養4?5h。

10.加入6或7滴秋水仙胺溶液，顛倒混勻。

11.37℃水浴鍋中培養20min。.

12.170g離心10min。

13.棄去上清，留約0.5mL液體。輕彈離心管幾次，徹底重懸細胞，避免細胞結塊。迅速加入0.5mL 75mol/L KCl(預熱在37℃)，輕彈離心管充分混勻，繼續加入4.5mL KC1。

14.37℃水浴鍋中孵育15min。

15.用巴斯德吸管，向每個管中從管底開始緩緩加入1mL新鮮配制的固定液，輕輕顛倒混勻。

16.170g離心10min。

17.棄上清，殘留約0.5mL液體。

18.邊混勻邊逐滴加入新鮮固定液至5mL。

19.室溫孵育約10min。

20.170g離心10min。

21.棄去上清，殘留約0.5mL液體，將沉淀打散。

22.邊混勻邊逐滴加入新鮮固定液至5mL。

23.必要的話，再重復步驟20?22，2或3次。

24.棄去上清。

25.稀釋沉淀至適當濃度。溶液應混濁、輕霧狀（如果得到沉淀較多，加入1?1.5mL固定液；如果得到沉淀較少，加入<1mL固定液）。

26.按下述二所述方法滴片。

二、正常男性中期染色體標本的制備

1.準備一個封閉環境，其相對濕度約55%(可在50%?60%變化），溫度24?26.5℃。

2.將巴斯德吸管置于玻璃載片上方2?4in處，讓一滴細胞懸液滴在玻片的左側。然后迅速將第二滴細胞懸液滴在玻片右側（見注釋7)3.在固定液全部蒸發前，將玻片浸入盛有新鮮固定液的染色缸1?3s，將玻片自染色缸中取出，在如步驟1所述的封閉的濕度/溫度環境中晾干片子。

4.在光學顯微鏡T檢查染色體標本的質量。

5.染色體標本在室溫下過夜，然后浸入1%福爾馬林中4℃固定5?10min。

6.染色體標本系列乙醇脫水，70%、85%和100%乙醇中各2min。

7.標本在室溫下晾干，或在實驗室抽風櫥中微風吹過標本使標本快速干燥。

8.在室溫儲存標本2?4周。

9.用正常參考與正常人樣品或已知不平衡性染色體異常樣品，對其中一張染色體標本片進行CGH分析。

三、患者和正常人樣品高分子質量DNA的提取

按照生產商提供的說明書進行DNA提取。也可以選擇用標準方法或任何可靠的DNA提取試劑盒提取DNA。

四、用缺口平移法標記探針

1.熒光素-12-dUTP用于標記患者DNA，德克薩斯紅-5-dUTP用于標記參考DNA。

2.準備15℃水浴鍋，或向裝滿自來水的冰盒中加入少量的冰直到溫度降到15℃。

3.將另一個水浴鍋設置為72℃。

4.向1.5mL離心管中加入下述試劑（所有試劑置于冰上）：1μg患者或參考DNA、5μL 10×反應緩沖液混合物、5μL dNTP混合物、1μL熒光基團-dUTP(l mmol/L)、1μLDNA酶（0.01?1U/μL)和2.5μLDNA聚合酶I(10U/VL)。

5.加水至總體積50μL。

6.將離心管短暫離心，使所有試劑都沉至管底。

7.在15℃水浴中孵育60min。

8.在72℃水浴中孵育10min終止反應。

9.在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢查DNA片段大小。最適于CGH的DNA片段大小為300?2000bp(圖3)。如果片段太長，加入DNA酶I在15℃水浴中繼續孵育。

10.可以進行大量樣品的缺口平移標記。

五、CGH探針的制備在1.5mL離心管中加入下述試劑：

1.用缺口平移法標記好的正常（參考）DNA200ng。

2.缺口平移法標記好的患者DNA200ng(10iLtL)。

3.20?30μg Cot1-DNA(20?30μL)(見注釋11)。

4.1/10體積的3mol/L乙酸納。

5.150μL(大于2倍體積）100%冰冷乙醇。

6．在-80℃放置40?60min。

7.29000g(或離心機最大轉速）于4℃離心40min。

8.輕輕倒掉乙醇。

9．用無菌的有棉花尖頭的涂布器吸干殘余的乙醇（不要碰到沉淀）。

10.將離心管置于電熱板（42℃)上的金屬架上，蒸發殘余的乙醇，需時2?3min。

11．用101μL Hybrisol VII雜交混合物重懸沉淀，用上下抽吸混勻，渦旋振蕩約1min.

12.CGH探針可以直接使用或于-20℃避光保存備用

六、中期染色體標本的變性

1.在染色缸中加入大約50mL變性液，將染色缸放于75?76℃水浴中。預熱變性液使其溫度達到（73±2)℃。

2.從-20℃冰箱中取出實驗所需的標本，室溫下系列乙醇脫水，各2min。

3.室溫干燥片子（5min)，或在實驗室抽風櫥中微風吹過標本使標本干燥。

4.在37?40℃電熱板上預熱片子30s。

5.將標本浸入（73±1)℃的變性液中變性2.5?5min。

6.迅速取出標本，放入冰冷的70%乙醇中3min，然后在85%和100%乙醇中脫水各3min。

7.晾干標本玻片（5min)，或在實驗室抽風櫥中微風吹過標本使標本干燥。

七、探針變性

在中期染色體標本片系列乙醇脫水的同時，將裝有CGH探針的離心管在(75±1)℃水浴中變性10min。

八、雜交

1.將注射器針筒（已將枕頭去掉）中吸入橡皮泥。

2.將標本片在37?40℃電熱板上預熱片子約1min。

3.標本片在電熱板上，將每個CGH探針加到標本的同一個雜交區域上，每個雜交區域蓋上22mm×22mm玻璃蓋玻片。

4.用注射器擠壓橡皮泥，沿著蓋片邊緣進行封片。

5.37℃濕盒中孵育標本2?3d。

九、雜交后洗脫

1.在染色缸中加入大約50mL的2×SSC溶液，預熱使其溫度達到72℃左右（水浴鍋溫度設置在大約75℃)。

2.在染色缸中加入大約50mL的4×SSC溶液，預熱使其溫度達到37℃左右（水浴鍋溫度設置在大約39℃)。

3.在染色缸中加入大約50mL的4×SSC/0.1%Triton×-10O溶液，預熱使其溫度達到37℃左右（水浴鍋溫度設置在大約39℃)。

4.在染色缸中加入大約50mL的2×SSC溶液，室溫放置。

5.在染色缸中加人大約50mL的蒸餾水，室溫放置。

6.從標本片上除去橡皮泥。

7.輕輕滑掉蓋片（不要劃傷標本)。

8.將標本片置于（72±2)℃的2×SSC溶液中，晃動標本片2min，然后在該溶液中停留5min。

9.將標本片轉移到37℃的4×SSC溶液中放置5min。

10.將標本片轉移到37℃的4×SSC/0.1%TritonX-100溶液中放置5min。

11.將標本片轉移到37℃的4×SSC溶液中放置5min(可使用與步驟9中的同一溶液)。

12.將標本片轉移到室溫下的2×SSC溶液中停留5min。

13.將標本片轉移到室溫下的水中停留5min。

14.標本片自水中取出，置于暗處室溫晾干；或在實驗室抽風櫥中微風吹過標本使標本快速干燥。

15.在標本片的靶區域上加10μL DAPI復染劑。

16.蓋上蓋玻片。

17.將標本片置于暗處5?10min，然后進行CGH圖像抓取和分析。

18.拍攝至少常染色體各10個，性染色體各7個。

1.一般選擇正常男性對照，這樣使得一張中期染色體標本片中同時有X染色體和Y染色體。

2.如果初步細胞遺傳學分析已在其他實驗室完成，患者的血樣應放入有肝素鈉的管中，可隨后進行提取DNA或需要的話進行外周血培養用于FISH實驗。在這種情況下，采血量最好超過3mL。如果患者是嬰兒，采血量通常小于3mL，只要血量足夠進行DNA提取即可。

3.可以提取大量男性和女性參考DNA，儲存在-20℃備用。

4.每批新的DNA酶要進行0.0?0.1U/mL的濃度梯度實驗，通過瓊脂糖凝膠電泳以確定哪種濃度能得到最理想大小的DNA片段，一般用該濃度的DNA酶進行標記效果理想。

5.—次標記超過1μgDNA可得到大量的標記參考DNA，可歸存在-20℃。

6.應制備一張標本片進行預試驗以確定有絲分裂指數，評估是否需要用固定液稀釋細胞懸液，或離心后用較少體積的固定液重懸細胞。

7.—張載片上滴兩個區域，可以在一張片子上同時進行兩個不同的CGH實驗，但是應確保兩個區域的染色體都分散良好。

8.進行中期染色體標本片的制備，其目標是：①得到的中期染色體分散均勻、相當染色體臂比較直、染色體之間重疊較少；②載玻片和染色體上殘留的細胞質盡可能少；③相差顯微鏡下觀察中期染色體呈現灰色[不太黑和（或）太亮，也不太淺或太朦朧]。

9.中期染色體標本片的質量是CGH過程中最關鍵的因素。每批標本片都應進行預實驗，質量比較好的標本片儲存在-20℃。在滴制片后約兩周進行預實驗，一旦結果滿意，在-20℃儲存這批標本片。一般整批標本片的質量相似，如果一批標本片沒有得到滿意的結果，這批標本片可以用于其他實驗如FISH，或扔掉。在精通中期染色體標本制備的實驗室中，應該首選他們常用的中期染色體制備方法。許多情況下，能滿足注釋8中標準的中期染色體同樣適合CGH分析。

10.制備CGH探針時，應考慮制備兩種不同的探針，一種是與患者性別相同的參考探針，另一種是性別不同的參考探針。性別相同的探針在揭示染色體(包括性染色體）的不平衡性染色體異常時非常重要。如果一張片子的兩個雜交區域采用兩種探針（見注釋7)，性別不同的參考探針可以作為內對照，因為預期整條性染色體顏色比率不同。

11.標記病例（marker case)中采用約20μgCot1-DNA，而所有其他病例中采用約30μgCot1-DNA。絕大多數的標記染色體含有著絲粒，對于某些病例采用較少的Cot1-DNA提高檢測效能。

12.變性液應預熱至少30min。溶液可在微波爐中用最高檔20s以加速預熱過程。

13.確定每批標本片的最適變性時間。合適的標本在較大范圍的變性時間內都可得到好的雜交結果和DAH反轉帶型。最初變性時間可以嘗試3.5?4min。