即使選用最好的指示劑和最佳的儀器，有些光學信號仍然很弱，伴有或只有噪聲。
另一方面，所用探測器的靈敏度可能很差，或所測生理指標性質上為量子性信號。無論怎樣，都要格外注意從背景噪聲中提取出所需要的信號。噪聲可能包括：系統噪聲和隨機噪聲。
在某些情況下，系統噪聲能被檢測出來，進而能用減法或除法取消其影響。相反，隨機噪聲就很難與有效信號相分離。信號平均是消除真正隨機噪聲影響的方法之一，不過，信號乎爲有時并不可行（如非固定事件)。在單一掃描記錄中，只有那些與信號在頻譜上可分離的隨機噪聲成分能被清除（如通過濾波)。
為了克服光學記錄實驗中的噪聲問題，可以使用許多信號處理和降低噪聲技術，它們包括：源噪聲比值法、數字濾波法、信號平均法。
存在于實驗記錄中的系統噪聲可分為兩類：相加的或相乘的。通常，相力帷噪聲可用減法去除，而相乘性噪聲能通過比值法進行最好的校準。由信號源強度變異所產生的相乘性噪聲，是光學記錄實驗中最常見的噪聲源，尤其在熒光相對變化等于或小于光源產生的波動時特別明顯。在這種情況下，很難從噪聲中分離出有效信號，這對于激光光源來說是個很普遍的問題，因為這種光源強度的變異能達到 5% 峰-峰值。然而，這些變異可以測量，并用比值法從信號中消除掉。實際上，對信號測量值和參考測量值進行比值計算，是去除源噪聲最有效的方法。此法比減法更優越之處，在于不需要在信號與參考之間進行振幅匹配，Bullen 等（1997) 對此法的有效性進行了描述，圖 4-5 通過一個實例來說明。
另一種消除源噪聲變異的方法，是計算兩個發射光波長之間比值，此時，源噪聲的變異作為共同模式信號存在于兩種波長中，也就可通過比值計算處理而被有效消除。
數字濾波是一種重要的信號處理工具，常用于降低隨機噪聲或有害信號在記錄信號中的影響（請參考第四十五章)，這對于不固定的信號和不能平均的信號來說是非常有用的。數字濾波法的原則，是將有用的頻率根據其是信號還是噪聲而被分離出來。以下是四種主要的數字濾波類型：低通法、高通法、帶通法、帶阻法。
在控制實驗記錄帶寬以保留有用的信號成分而去除高頻成分方面，低通濾波器是很重要的。高通濾波也稱為 A/C 耦聯，有利于去除信號中的直流成分，只顯現變化的部分。帶阻（或切跡）濾波器阻止某一特定帶寬，在去除實驗記錄中的交流噪聲特別有用。
另有特殊的濾波器，既可保留高頻成分又發揮低通濾波器功能，其中一個例子是 Savitzky-Golay 濾波器法，基本上是在局部區域進行多項回歸，進而為每一數值點確定一個平滑化的值。這種方法之所以優于其他濾波方法，在于它能保留數據特征如峰高和波寬，而這些特征通常會被相鄰數據平均法和低通濾波「洗掉’
通常在科研制圖軟件包中有這些數字濾波器的各種應用（如 Origin 或 SigmaPlot), 在特殊的數學軟件中也可找到（如 Matlab 或 Mathematica)。
注意：務必避免濾過頻率中含有重要的信號成分，而且，必須承認有些濾過方法會導致數據出現小的相位偏移，不過現在的限定脈沖反應（FIR) 數字濾波器能反向應用以解決這一問題。最后，應當注意不要違反采樣的原則（參見第四十五章「數據的采集和數字化」)。
注意：在所有數據獲取或處理的各個階段（從探測器開始）都應用模擬濾波器（主動的或被動的)，無疑是明智之舉，這能明顯降低有害噪聲在每一階段的聚集，并減少隨后數字濾波的需要程度。
信號平均法是指按區域或重復測試的時間或空間上進行歸類，以降低隨機噪聲的影響（參見第四十五章)。如果噪聲真是隨機的，那么信號平均法能按因素 Jvl 降低噪聲，N 是測試重復的次數。這種平均法要求事件固定并包括所有出現的頻率成分，即用于平均的信號是嚴格的時間-鎖定事件。如果采用信號平均法，應注意不要導入任何時間性顫抖（如生物性或儀器性的)，否則會引起低通濾波效應。在有這樣問題的情況下，像動作電位這樣的事件可以按其峰值分類，并進行平均化以提高整個信號的質量。
信號平均法的效果例示于圖 4-6。在這個例子中，給出的是檢測 VSD 比值法數據線性問題的實驗，隨著實驗次數增加，平均信號法使相對噪聲成正比降低。
實時平均法的一個缺點，在于總體測試頻率通常會降低，因為要花時間采集足夠的記錄次數用于平均。這限制了在一定時間窗內能夠采集的數據點數，進而在那些對藥物或實驗操作的反應時程很重要的實驗，可能是一個問題。
這一部分將介紹實驗結果的表達和展示方面的重要原則。它們包括.
—數據表達
—實驗記錄的重要特性
一實驗的類型及典型的記錄
從單神經元或部分神經元獲得的光學記錄結果，可以多種方式進行表達，具體包括以下幾個方面。
—-維記錄：從單一位點記錄的信號，或從圖像的單獨點或單獨區域（ROI) 提取的數據，顯示為一維的對時間作圖的記錄線
_偽色成像：以區別活動水平或離子濃度變化的一系列彩色圖像一實況錄像：直接來自實驗中獲取圖像的、有時可調速的再現資料盡管錄像和偽色成像提供一個優質的、定性顯示的數據，但這種方法常常難以顯示時間過程和 (或) 定量的變化 r 而且，還難以將這些圖像與其他同時測量的一維參數（如電流、電壓）進行綜合分析。
現在的文章中有一個令人遺憾的傾向，就是提供過度簡化的數據，而且在許多情況下原始數據被完全省略了。這種情況確實存在于光學記錄研究中，即許多記錄常常被簡化成單一的偽色圖像。然而，為了他人能對有效數據質量進行判斷，提供一些原始記錄仍然是重要的。在檢查這一類數據時，對如下各種問題進行考慮是重要的，如提供的記錄是否有以下顯示：.
一檢測的靈敏度：對于所做的測量來說，記錄方法和使用的指示劑是否足夠靈敏
—信/噪比：給出的信/噪比是否足以獲得有用的實驗結論？是否還能進一步優化
一時空分辨率：選用的方法是否有足夠的時空分辨率回答實驗所提出的問題
一保真度：所提供的記錄是否為有效生理學事件的精確反映？有無記錄方法本身造成的干擾和變異存在
本章提供了許多實驗記錄，用以說明在單神經元實驗中可能見到的各種實驗記錄類型。例如，前面提供的比值信號取自檢查 VSDdi-8-ANEPPS 線性關系的試驗。這一記錄是在緊貼膜片鉗電極旁的掃描位點獲得的，證明了在光學信號和電壓鉗指令波形之間，存在著反應時間和幅度上很好的一致性。此類校準隨后能量化在更接 ia 生理條件下完成的類似光檢測數據。
在用同樣 VSD 的一個不同例子中，檢測了培養的海馬神經元突觸后電位在樹突的整合在海馬和傳導模式（圖 4-7)。這個實進驗能從多方面進一步說明這種光學記錄法的用途。特別是這些記錄系用非侵入方法從很小細胞獲得的。而且，在不同記錄位點（直徑 2ym) 幾個檢測可同時進行，這對其他方法來說并非易事。再者，這些信號的獲取頻率（如 2kHz) 足以充分地對欲測生理學事件進行采樣。
在一個類似的實驗中，檢測了在一連串動作電位之后，同一細胞鄰近位點所產生鈣信號的空間差異性（圖 4-8)。此例證明了在同一細胞不同位點之間，以高時間分辨率檢測到鈣瞬流的幅度和動力學上的空間差異性。
這部分介紹一些在光學記錄實驗中常見的問題，主要對以下幾個方面加以描述:
一信號質量問題
一光動力學損傷的預防
一負載和染色問題
所有記錄技術中最重要的因素就是所能達到的的信/噪比（S/N)。這對一些光學指示劑（尤其是 VSD) 來說尤為重要，因為它們的相對熒光變化非常小。許多因素能影響信號質量，包括以下幾個方面。
激發光強度：由光學指示劑產生的熒光直接與激發光強度成正比，因此應該選用可能的最強光源，不過要注意避免過強光照導致指示劑的漂白和光毒性。
指示劑濃度：發射光強度亦與指示劑濃度成正比，故應盡可能選用最大量探針。不過又要注意避免染料的濃度有藥理作用或緩沖作用，這可改變欲測生理學參數（詳見「負載與染色問題」)，而且在很高的指示劑濃度下，發射光強度由于「猝滅現象」而開始衰減。
激發容量：在掃描顯微鏡中，來自大的激發容量（如較大的掃描點）的信號要強于小的激發容量，因為更多的熒光物被激發。因此在小的掃描點空間分辨率高，但激發容量及信號強度降低，這是需要平衡的問題。
指示劑敏感性：最佳信號質量來自于高敏感性的光學指示劑，因此在選擇指示劑時，應選用敏感性高的指示劑。
指示劑亮度：在選擇指示劑時，總應選擇亮度最高的一種。比較絕對指示劑亮度的指導原則將列于后一部分 (「比較指示劑的標準」)。
最大聚光效能（N.A. 和濾光片）：應該重點牢記的是，聚光效能取決于以下幾個因素，包括數值孔徑（N.A.)、物鏡的絕對傳遞能力、顯微鏡的相對容許能力和分色鏡與相關濾光片 的傳光能力。一般來說 10% 的總聚光效能是很常見的，如果在不好的情況下這個值還會更低。所以，若選擇物鏡的話，應選擇最高 N.A. 值的物鏡。這樣的選擇會使光照強度最大化而發射光的聚集最優化。相似地，也應該注意選擇分色鏡和發射光濾光片，以免它們排斥大部分的信號。其他光丟失的可 能原因還有：使用 DIC 鏡片而沒有從發射光路中去掉分析器，不潔的鏡片或光路錯位。僅 DIC 分析器本身就可使發射光強度再減少 50%。
最大的檢測效能（Q.E.): 在各種情況下，尤其在光亮水平較低時，應優先選用一個可能量子效能最高的探測器，這可保證所獲得的光子能全部轉化成有用的信號（表 4-5) 〇
記錄帶寬：記錄帶寬只需足以獲取有效信號即可。超過記錄所需的時間帶寬，只會增加噪聲。但是，如果存在額外的時間帶寬，可被用于通過數字化附加采樣來提高 信號質量。附加采樣是指平滑處理時間的方式，即對先前幾個空間上相近的采樣點進行平均。這一方法可用于降低隨機噪聲，按 N-1/2 成正比地提高信噪比，N 是附加采樣的次數。
過度的光照強度有時會造成光損傷或光毒性。在許多情況下，這種現象源于自由基的產生，如熒光激發時的副產品單態氧。這些自由基可以干擾膜的完整性。尤其在 應用在質膜的 VSD 時，對膜的干擾是一個特別普遍的問題。減少熒光指示劑所致的光損傷有^種 T 同的方法，有些是在孵育液中加入大量抗氧化劑以使光損傷最小化，有些是在特定部位加少量抗氧化劑（如在細胞膜上)，還有一些方法是將氧自由基從溶液中徹底 清除。如下是一些例子：
1.ACE 等：最簡單的降低溶液中自由基作用的方法，就是在孵育液中加入大量的抗氧化劑，建議使用的抗氧化劑包括各種維生素（A,C 和 E;ACE) 和其他類似制劑 (如 Trolox;Fluka)。然而，使用這些物質的方法還沒有很成功的報道，可能是因為在損傷位點（如膜）不能提供直接的保護所致。這類制劑及其溶解和儲 存的資料一并列于表 4-7。
2.蝦青素：一種更直接的方法是用自然的類胡蘿卜素—蝦青素。這種物質最初用作抗氧化劑，是與一種新的基于熒光共振能量轉換原理的 VSD 合用（GonzalezandTsien1997)。從理論上說，這一方法的有效性比在溶液中使用的抗氧化劑強，因為它既能與膜密切結合，又有很強的去除 活性氧能力。同時，即使使用濃度很高，也不必擔心它的毒性作用。和其他的胡蘿卜素如卩-胡蘿卜素相比，蝦青素及其相對高的水溶性, 無疑是一? 種值得特別推崇的抗氧化劑。然而，初步報道表明蝦青素與其他類型 VSD 合用效果甚微。有關蝦青素的可溶性、儲存以及使用的相關信息請參閱 Cooney 等 (1993)。
3.葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶：葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶結合無疑有很強的除氧能九用于 VSDdi-8-ANEPPS 尤為有效（Obaid and Salzberg 1997)。葡萄糖氧化酶從溶液中攝氧生成過氧化氫，隨后過氧化氫酶將其轉化成水。這些酶的高催化活性，意味著相對少量的酶（葡萄糖氧化酶 40U/ml 和過氧化氫酶 800U/ml), 即足以在溶液中發揮去氧化作用。葡萄糖氧化酶（G-6125) 和過氧化氫酶（040) 均由 Sigma 提供（St.Louis,M0)。
4.Oxyrase:Oxyrase 是一個生物催化氧降解系統。它的商品制劑也用于細胞孵育液中除去活性氧。Oxyrase 系從大腸桿菌制備而來，作為天然制劑使用時，需要將乳酸、甲酸、號祐酸加入孵育液中作為氫供體。初步研究顯示其與熒光染料指示劑合用，在許多情況下都是一 種有效的抗氧化劑。Oxyrase 可從 Oxyrase 公司（Mansfield,0 H) 獲得。
光損傷的問題并沒有得到全面的解決，在許多情況下如何用好抗氧化劑仍然憑經驗行事。然而，上述提到的一些方法明顯比其他制劑有效。從我們使用 VSD 的經驗來看，葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的合用是單細胞短期實驗中效果最佳的方法。
關于 VSD 染色常有三類問題，它們是：
1.染色不足/膜親和力低：一些 VSD(如 RH414) 與某些種細胞有相對較弱的膜親和九而其他的 VSD(如 di-8-ANEPPS) 對細胞的染色又特別慢。這些染料的結合親和力部分與它們自身結構有關，但膜的構成也是個重要因素，而且還有顯著的種屬和細胞類型差異性（Ross and Reichardt 1979)。有三種方法可能解決這類問題。首先，，開始新的系列實驗之前，應對比較合適的染料進行篩選，找出與膜親和力最高、產土怡號強度最咼的染色劑。 其次，應該在大范圍的染色時間和條件上加以認真考慮，以確定最佳的染色條件。最后，在染料儲存液中加入一些試劑（如 0.05% PluronicF—127) 將有助于染料進入細胞膜。
2.過度染色：用過量的 VSD 會導致各種毒性作用。特別明顯的是，由游離染料或非特異性定位結合的染料所產生的非特異性熒光，可嚴重降低信號的強度和質量。更有甚者，用高濃度的 VSD 可能會有藥理學作用，因此推薦使用能產生最佳信號的低染料濃度。
3.染料內化：因為 VSD 滯留于細胞膜外層，這樣某些染料分子就有可能會跨膜進入內層，甚至直接進入細胞內并定位于細胞器質膜上。各種膜的循環過程也能幫助轉運 VSD 進入細胞內。這種染料內化的結果是降低了信號的強度，因為這些染料分子可能對膜電位缺乏敏感性，或具有與正常定位染料直接反向的敏感性。解決此問題的辦法 就是使用不易內化的染料（如 di-8-ANEPPS)。此外，高于室溫的孵育溫度也會增加染料內化進入細胞的可能性，故要盡量避免，
用 CaSD 負載細胞通常有四類問題，其中兩類與 AM 酯負載技術有關。它們是：
1.間隔作用：在理想狀態下，用這一技術負載的突光指示劑，應均勻地分布于胞漿中，而不存在于其他細胞區域。然而 AM 酯能聚集在細胞內任何一個膜封閉的區域內。此外帶有多價陰離子的指示劑，也能通過主動轉運而潴留在各細胞器內。這種異常的隔離作用，通常是由于升高負載溫 度造成的，故通過降低負載溫度可以避免。使用與葡聚糖結合的指示劑也能降低分隔和潴留效應。
2.不完全的酯水解：低的或慢的去酯化率，能導致細胞內部分去酯染料比率的顯著增加，它們對鈣離子不敏感，但仍然有些熒光。這會導致明顯低估細胞漿內真正 鈣離子濃度。此外，不完全酯水解也能促進間隔作用。用只能與去酯形式染料結合的 Mn2+進行熒光猝滅，是對這一作用進行定量分析的方法。避免 AM 酯異常熒光效應的方法之一，就是選擇那些酯化物不發熒光的指示劑。例如，鈣綠和俄勒岡綠 488BAPTA 基本上是非熒光的 AM 酯，而 Fura-2 和鈣橙黃的 AM 酯仍然有一定的基礎熒光。
另外兩個在 AM 酯負載和 CaSD 游離鹽溶液的微量注射或透析均可出現的問題是：
1.過度染色：不管是用 AM 酯或鹽溶液負載單神經元，必須要注意避免過度負載細胞，否則會造成有害的緩沖效應。這種緩沖可影響靜息鈣離子濃度、鈣瞬流的大小和動力學，并干擾依賴轉離 子的各種細胞話動。簡言之，使用不正確的指示劑濃度，將會導致信號質量差，直至失真的生理學結果。證明所記錄的信號沒有受到任何緩沖作用影響的一個方法， 就是在全部指示劑濃度范圍進行實驗。
2.漏出：許多陰離子指示劑在某些細胞中易于漏出或主動滲出。在一些情況下，可用藥理學工具藥（如丙黃舒、苯磺唑酮和維拉帕米）將其阻斷。另一個方法就是 設計一種有抵抗力的指示劑，特別是與葡聚糖結合的染料通常都能抵抗滲出和漏出。如今，得克薩斯突光實驗室 （TexasFluorescenceLabs,Austin,TX) 已經研制了一系列這樣的漏出抵抗型鈣離子染料（如 FuraPE3,IndoPE3,FluoLR)