實驗概要
mESCs建系
主要試劑
細胞基礎培養液、DPBS、0.25%Trypsin、0.1%明膠、兔抗鼠全血清原液、豚鼠補體、0.5%鏈蛋白酶、沖胚液、培養液A、mESCs培養液B
主要設備
35 mm、60 mm、100 mm培養皿、15 mL離心管、50 mL離心管、體視鏡、注射器、鑷子、虹膜剪
實驗材料
小鼠（3.5 dpc），即見陰道栓后3.5天的懷孕小鼠
實驗步驟
（1）胚胎的獲得
①取懷孕3.5 dpc的孕鼠，用斷頸法處死。
②用75%酒精消毒孕鼠，盡量噴濕全身。
③打開腹腔，用虹膜剪和鑷子修剪去脂肪和系膜（用鑷子將子宮輕輕拉起，使系膜和脂肪張開，然后用虹膜剪緊貼子宮將系膜與子宮分離），從輸卵管根部及子宮下端分叉處剪下雙側子宮，將雙角子宮于陰道處剪斷。
！注意：沖胚時選擇合適大小的鑷子、剪刀，直鑷、直剪。
④注射器吸入沖胚液CZB，配以剪平頭的4＃至6＃針頭，用鑷子（最好是直頭鑷子）輕輕從一端（細端，即連接卵巢的一端）插入子宮腔內2～3
mm（注意，針頭尖端很銳利，不要將子宮壁戳破），用鑷子輕輕夾緊，吹入沖胚液（最后一滴若不滴下，可輕輕貼一下平皿側壁使液滴進入平皿），再從另一端（粗端，即連接陰道的一端）插入，吹入沖胚液。
！注意：沖胚的針應事先剪成平頭，滅菌，因為尖針頭端很銳利，容易將子宮壁戳破。
⑤將盛有沖胚液的培養皿置于解剖鏡下，用口控吸管（直徑1.1～1.2
mm，末端直徑約100
μm）吸取少量（充滿毛細管尖端細管部分即可）細胞基礎培養液（防止胚胎粘在毛細管壁上，無法吹出），用口控吸管將胚吸出。如果是早期囊胚或桑椹胚應該先在細胞基礎培養液中培養過夜至晚期囊胚再進行處理。
（2）mESCs的建系
1）內細胞團接種法建系
（1）免疫外科法分離內細胞團
①去除透明帶：將囊胚吹入0.5%鏈蛋白酶中，反復吹打囊胚，1-2分鐘左右透明帶逐漸變薄最終消失，立即將去除透明帶的囊胚吸入沖胚液中，并反復吹洗。
②將胚胎移到CZB培養3 h，。
③將去除透明帶的胚胎移入含兔抗小鼠IgG血清的DMEM培養液中（1:30），置于培養箱中處理30 min。
④將胚胎移入新鮮的豚鼠血清補體中處理胚胎10-15 min，溶解滋養層細胞。處理過程中，隨時觀察。當滋養層細胞膨大，呈透明空泡狀即終止處理，用沖胚液洗滌3次，來回吹打去除滋養層細胞。
注意：將胚胎從兔抗鼠全血清原液移入豚鼠血清補體時，不用DPBS洗，直接放到補體中，處理效果較好；用DPBS洗后再放到補體中，處理效果不好。
⑤用沖胚液吹洗胚胎3次。
⑥將胚胎移回CZB滴中，培養24 h。
⑦如有需要重復第⑤～⑥步，重新用兔抗鼠抗體和豚鼠血清處理胚胎，去除殘余的滋養層細胞。
⑧將去除滋養層細胞的內細胞團【受精卵發育為胚胎的過程中，隨著細胞的分裂增殖依次經歷卵裂期→桑椹胚→囊胚→原腸胚。細胞的分化則是從囊胚期開始的，在囊胚期，一部分個體較大的細胞聚集在胚胎（球形）一端，稱為內細胞團，將來發育為胎兒的各種組織器官。】
（2）接種內細胞團并建系
（a）全內細胞團接種法
①將分離出來的內細胞團細胞移至mESCs培養液B培養液內，繼續培養。
②培養48 h后，可見內細胞團生長，3～5天后內細胞團進一步增大，此時可以進行傳代。
（b）消化接種法
①將內徑0.5 mm，長100 mm玻璃管一端在火焰上灼燒、拉細，用砂輪將末端切斷。準備末端口徑比內細胞團稍大(約50μm)和稍小(約30μm)兩種。
②用末端口徑比內細胞團稍大的毛細管挑起內細胞團，吸至0.25%Trypsin消化液內，消化至3～4個細胞在一起的團塊，加少許mESCs培養液B稀釋0.25% Trypsin。
③將分散的內細胞團小塊吸至準備好的飼養層上，在mESCs培養液B中培養。
④培養48 h后，可見胚胎干細胞小集落出現；3～4天，集落進一步增大；6～10天，可進行消化傳代。
（2）全胚接種法建系
①沖胚過程見本章“胚胎的獲得”部分
②將沖出的囊胚吹入提前一天接種了飼養層細胞的4孔培養板，換用mES培養液A或者B，每孔中放5～7個囊胚；
！注意：沖出的胚比較易于聚集在皿的邊緣，需要小心
③放入培養箱中培養。囊胚逐漸長大，最后貼壁，滋胚層展開，ICM不斷增殖。
！注意：胚胎接種到飼養層細胞上之后，前幾天不要動4孔培養板，因為這個時候ICM還沒有完全貼壁。
④培養4～6天后，ICM成為一團圓柱形細胞團（近似垂直于培養皿表面），將ICM進行消化傳代；一般要培養6～7天，ICM才成為一團圓柱形細胞團，此時可以用機械切割的方法或者Trypsin消化的方法進行傳代。此時將細胞的代次記為P1（即Passage 1）。成功建立的mESC系之后可以進行常規的傳代、培養和凍存。mESCs細胞核大，有一個或幾個核仁，胞核中多為常染色質，胞漿少，結構簡單，細胞排列緊密，呈集落狀生長，如圖3-3所示。
！注意：機械切割傳代時要徹底去掉雜細胞，盡可能少的帶入滋養層細胞；一個圓柱形內細胞團放到一個孔里。
如果克圓柱形內細胞團完全從透明帶孵化出來，可以用0.25%Trypsin消化傳代，最好用含有1%雞血清的0.25%Trypsin進行消化，消化過程中可在顯微鏡下觀察，當細胞變得松散時即可用細胞基礎培養液終止消化。