實驗概要
hESCs傳代、凍存及復蘇
主要試劑
KODMEM、0.25%Trypsin、1 mg/mL膠原酶Ⅳ或者Dispase、0.1%明膠、細胞基礎培養液、hESCs培養液、凍存液C
主要設備
2 mL移液管、5 mL移液管、10 mL移液管、15 mL移液管、25 mL移液管、15 mL離心管、50 mL離心管、計數器、巴斯德管、倒置顯微鏡、培養箱、水浴鍋、生物安全柜、體視鏡
實驗步驟
1）hESCs的傳代
！注意：傳代的前一天復蘇飼養層細胞。
①觀察細胞克隆大小及飼養層狀況，當克隆完全展開并生長時進行傳代，一般傳代5～7天后，就可以進行另一次傳代。
②傳代前的半個小時，將將飼養層細胞中的培養液換成hESCs培養液。
③棄去原培養液，加入1 mL KODMEM到1個6孔培養板的孔清洗細胞。
④棄KODMEM，每個6孔培養板的孔加入1 mL濃度為1 mg/mL的膠原酶Ⅳ，放入CO2培養箱中孵育5 min。
！注意：消化hESCs時，消化時間和酶的活性有非常大的關系，新配制的酶溶液消化時間是5 min左右；如果所配酶溶液存放時間過長（超過兩星期）可能導致消化時間較長，請根據鏡下細胞狀態適當延長時間。
⑤觀察克隆的邊緣是否與飼養層分開并發亮、稍微卷起
⑥棄掉上清，加入2 mL hESCs培養液，用1 mL的移液槍柔和吹打細胞15 s左右，然后鏡下觀察，待克隆已成大小相對均一的塊狀，1000 r/min室溫離心2 min，收集細胞。
！注意: 吹打細胞時可以選擇1 mL槍頭也可以用玻璃巴斯德管，不管用巴斯德管還是用槍頭，都需要對巴斯德管頭或槍頭進行處理，最好是光滑圓潤狀，以不傷害干細胞為好。
⑦棄掉上清，用hESCs培養液重懸，在起初密度較滿的情況下，1：6進行接種。
2．hESCs的凍存
①～⑤同hESCs的傳代步驟①～⑤。
⑥棄掉上清，用凍存液懸浮細胞。每個凍存管內加入0.5 mL細胞懸液。然后用程序凍存盒或分步法凍存。
！注意: 由于hESCs較難復蘇，很多公司推出了成品的hESCs凍存液，可以選擇成品的凍存液，也可以實驗過程中現用現配。配制好的凍存液可放于4℃冰箱暫時保存半天左右。
3．hESCs復蘇
①準備15 mL離心管，加入hESCs培養液9.5 mL。
②液氮中取出凍存管，迅速放入37℃水浴鍋融解細胞懸液。
③75%酒精擦拭凍存管，柔和吸出凍存液，緩慢加入已準備好的離心管中，室溫1000 r/min離心2 min。
④棄上清，加入hESCs培養液懸浮，按照凍存管上標記的密度進行接種。
！注意：復蘇過程中勿劇烈吹打。