實驗概要
人胚胎干細胞分化成神經前體細胞和多巴胺能神經元
主要試劑
DPBS、DMEM/F12、1.5
U/mLDispase、鼠黏連蛋白（Laminin，20
μg/mL）、1U/MlAccutase酶、人胚胎干細胞擬胚體形成培養基、神經誘導培養基（NIM）、人神經分化培養液（NDM）、FGF8（50ng/mL）、SHH（100ng/mL）、Vc、cAMP、TGFβ3、BDNF、GDNF
主要設備
一次性5mL或10mL移液管、6孔板、T25培養瓶、T75培養瓶、15 mL或50 mL離心管、0.22μm一次性濾膜
實驗步驟
（1）收集hES細胞，懸浮培養形成擬胚體（Embryoid body, EBs）
①實驗開始前10min，在37℃水浴中孵育DMEM/F12、1.5 U/mL的Dispase和EB培養基。
② 吸去6孔板中各孔hES細胞的培養基。
③用DMEM/F12洗細胞一次。
④吸去DMEM/F12后，在6孔板的每個孔中加入1mL的1.5 U/mL的Dispase。
⑤ 在培養箱中孵育5～15min，定時在相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。當顯微鏡下觀察到hES細胞的邊緣開始卷曲時，從6孔板中吸掉Dispase并加入DMEM/F12輕柔吹打細胞。
⑥ 用一次性的5mL或10mL移液管收集hES細胞克隆。用移液管管頭將皿底的hES細胞從底面上劃下來，并上下反復輕柔吸打將克隆打碎成直徑200μm左右的細胞塊。
⑦ 室溫800r/min離心2min，吸棄上清，用EB培養基重懸干細胞克隆，并將細胞懸液轉移至T25或T75培養瓶中。
⑧ 懸浮培養12～18h后更換新鮮培養基，去除死亡的細胞，如果有必要的話可以更換培養瓶去除殘留的已貼壁的飼養層細胞。
（2）神經上皮細胞的分化
① 分化4日后，傾斜放置培養瓶，將擬胚體聚集于培養瓶一角后，吸去所有EB培養基，用NIM重懸，繼續培養。
② 兩日后半量換液。
③ 次日，將擬胚體懸液轉移至離心管，靜置10～15min使集落沉淀于管底，去除培養基。
④ 用含20 μg/mLLaminin的NIM培養液重懸細胞，將1個T75瓶中的hES集落接種于2個6孔板中。
⑤ 第二日吸出含Laminin的NIM培養液，6孔板的每個孔加入2mL新鮮的NIM。
⑥ 每隔一日更換一次新鮮的NIM培養液。每日觀察，在貼壁2～3日后克隆中的細胞將形成花環樣結構，這一時期我們稱之為原始神經上皮。
⑦ 在NIM進一步培養4～5日，花環的緊密程度將增加，并且每個克隆可包含多重神經管樣的花環內腔，這個時期可稱之為神經上皮。
（3）神經上皮的富集與擴增
在分化第14～16日形成神經管樣花環結構后，吸出每孔舊的培養基并加入1mL的新鮮NIM培養基。
用1mL移液管溫和吹下神經上皮結構，收集于離心管中。
用5mL或10mL的移液管上下來回吸打幾次，將神經上皮結構吹成小塊。
室溫700r/min離心2min，吸棄上清。
⑤ 用NIM培養液重懸細胞沉淀，并將細胞懸液轉移至T25培養瓶中。
⑥ 次日觀察，可發現花環結構重新卷曲成球形懸浮生長。
⑦ 每隔一日用含1% B27的NIM培養液給懸浮成球生長的神經前體細胞半量換液。
（4）由神經前體細胞分化形成神經元
①神經上皮集落可以懸浮培養數周至幾個月。
②將圓形蓋玻片放于24孔板中，在使用前用0.1mg/mL的多聚鳥氨酸孵育過夜，此后再加含20μg/mL laminin的NDM，37℃放置3h以上。
③在37℃水浴中溫浴Accutase酶、DMEM/F12和NDM培養基。
④收集神經上皮細胞集落于15mL離心管中，讓集落自然沉淀于管底。吸去培養基。
⑤加入500μL的Accutase酶37℃孵育2～3 min。加入等量的NIM培養基稀釋酶的消化作用，室溫1000r/min離心3min。
⑥吸棄上清，并用DMEM/F12洗滌一次。
⑦ 向管中加入1mL的NDM培養基并用200μL移液器的槍頭在管底來回吸打將細胞打碎成小的群落或單個細胞。
⑧ 將細胞接種于事先經過多聚鳥氨酸和Lamin處理的蓋玻片和培養皿中。6孔板中的每個孔可以接種50～60個集落，一個蓋玻片可以接種8～10個集落。
⑨在細胞接種后2～3h觀察細胞是否貼于培養皿底部，如果已經貼壁，則在6孔板的每個孔中加入2mLNDM，在24孔板的每個孔中加入0.5mLNDM。
⑩ 用相同的培養基每隔兩日給細胞換液一次，2-3日后可以觀察到神經元的神經突觸。
（5）人胚胎干細胞分化為中腦多巴胺能神經元
由hES細胞分化為原始的神經上皮細胞的方法如前所述，但是需要注意的是在此分化過程中，在分化至第8～10日時，在NIM培養基中加入FGF8b（50ng/mL）和SHH（100ng/mL）。
② 持續培養細胞7日，每隔一日用相同的加入FGF8b和SHH的培養基換液，直到形成神經管狀花環樣結構。
當分化至富集和擴增神經上皮細胞階段時，在NIM培養基中加入FGF8b（50ng/mL），SHH（100ng/mL），B27（1×)和Vc（200μM），并每隔一日換液一次。
④ 懸浮培養7日后，神經前體細胞集落用accutase消化成小團塊，接種于表面預先鋪有PDL和laminin的培養皿中。
⑤ 細胞貼壁后，每隔一日用含有FGF8b，SHH，Vc，cAMP，TGFβ3，BDNF，GDNF的NDM培養基換液，持續三周。
⑥ 在分化44日后，撤去含FGF8b，SHH的培養基，并用含有Vc，cAMP，TGFβ3，BDNF和GDNF的NDM培養基繼續維持細胞。
⑦ 在分化35日之后，可以用免疫熒光染色的方法對分化的多巴胺能神經元進行鑒定，如進行多巴胺能神經元特異性標記物TH的染色。