實驗概要
本文介紹了細胞組分分析方法的原理及操作流程等。
實驗原理
核酸分子雜交技術是目前分子生生物學、細胞生物學和生物化學研究中應用最廣泛的技術之一，是定性、定量和定位檢測兩條來源不同的聚核苷酸鏈上堿基順序同源性的一種手段。DNA分子是高度有序的雙鍵分子。一條鏈的堿基與另一條鏈的堿基以氫鍵配對相連．形成腺嘌呤與胸腺嘧啶(A．T)，鳥嘌呤與胞嘧啶（G．C）的特定堿基對；在RNA中則為A與U(尿嘧啶)，G與C配對。
在堿性環境加熱或加入變性劑的條件下，核酸分子雙鏈之間的氫鍵被破壞，解鏈成兩條單鏈(稱為變性)。此時如果加入已知DNA和RNA片段（稱為探針)，在一定的離子強度和溫度下，兩條具有互補堿基順序的DNA與相應的cDNA或RNA，RNA與相應的RNA或cDNA均可形成雙鏈分子結構(稱為復性)，這種由互補堿基順序的任何單鏈核酸分子片段形成雙鏈的過程稱為分子雜交(Molecular hybridization)。
核酸分子雜交可分為液相雜交、固相雜交和原位雜交等三種類型。
原位雜交(Hybridization in situ)即原位核酸分子雜交。此法最早(1969)用于細胞內核糖體RNA的定位等研究，現在被廣泛用來進行細胞內特殊核酸序列的定性、定位和定量的研究，被稱為原位雜交組織化學或原位雜交細胞化學(In situ hybridization cytoehemistry)。它是將重組DNA技術與組織細胞化學技術相結合，在細胞原位顯示某種特定基因，mRNA及其產物(特異蛋白)的表達、定位、半定量和變化規律的一種新技術。cDNA的制備因所顯示的mRNA的不同而各異，必須借助于重組DNA技術。mRNA在RNA依賴性DNA聚合酶的作用下，可反轉錄產生cDNA，因此先提取細胞中已知的特定mRNA，在反轉錄酶的作用下合成與其互補的cDNA，經限制性內切酶作用后插入載體質粒DNA內。再將該載體轉化大腸桿菌，擴增cDNA，然后分離純化cDNA，最后用缺口平移法進行同位素或生物素標記，作為探針待用。
寡聚核苷酸是一種短小的單鏈分子，比cDNA更易穿透組織細胞，并且可按基因片段的核苷酸序列人工合成。因此近年來人們常用它來制備核酸探針。
原位雜交細胞化學技術包括分子探針的制備，用同位素或生物素等標記探針，制作組織切片，預雜交、雜交，顯色過程和結果觀察等。
主要試劑
1. 缺口平移試劑盒
2. 硝酸纖維素膜
3. 去離子甲酰胺
4. 焦碳酸二乙酯
5. 鮭精子DNA
6. 純牛血清白蛋白(BSA)
7. LB培養基
8. 氨芐青霉素
9. 葡聚糖
10. 溶菌酶
11. 十二烷基硫酸鈉(SDS)
12. EDTA
13. 生物素(Bio-dUTP)
14. 金標鏈霉親和素
15. 檸檬酸，酚，氯仿，乙醇等
主要設備
1. 高速離心機
2. 電泳儀
3. 真空干燥箱
4. 恒溫搖床
5. 超聲波發生器等
實驗材料
玉米17SrRNA的cDNA，本實驗所用探針是玉米17SrRNA的cDNA，它是以1.5kb的片段插入在PBluescriptⅡSK(一)中MCS的saci位點上。
實驗步驟
1. 重組質粒的轉化
1) 將大腸桿菌(E·coli)JM109單菌落接在5ml LB培養液中，37℃振蕩培養過夜。
2) 以1％的接種量接入50ml LB培養液中，37℃振蕩培養至OD600大約為0.3-0.4時倒入離心管，冰浴10min，4000rpm離心10min，收集菌體。
3) 將菌體懸浮于25ml預冷的50mmol/LCaCl2溶液中，冰浴30min。離心收集菌體，并重新懸于3ml 50mmol/lCaCl2中。0℃放置12-16h，使之成為感受態細胞。
4) 取重組質粒0.1μg，加在200μl感受態菌體中，冰浴30min，于42℃熱休克2min后再冰浴2min。
5) 取lml LB培養液加入到上述菌液中，37℃培養45min。逐級稀釋后，用內含氨芐青霉素(60μg/ml)的LB培養液涂平板，37℃培養至菌落出現。
2. 轉化子的篩選及檢測
1) 對在氨芐青霉素平板上長出的菌落進行一次復篩，并培養菌體。
2) 按照微量DNA的提取方法(Sambrok et al．，1989)提取微量DNA，進行電泳，檢測出含有重組DNA質粒的轉化子。
3. 重組質粒DNA的擴增及制備
1) 將經過復篩的菌落，按1中方法(2)進行大量培養。
2) 取200ml培養液，4000rpm離心10min，收集菌體，棄上清液。
3) 加入4ml溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris，10mmol/L EDTA，pH8．0)，加入溶菌酶至終濃度為4-6mg/L，振蕩混勻，冰浴10min。
4) 加入8ml新配制的溶液Ⅱ(0.2N NaOH，10％SDS)，溫和顛倒離心管5次，冰浴5-10min。
5) 加入6ml預冷的溶液Ⅲ(5mol/L醋酸鉀60ml，冰醋酸11.5ml，重蒸水28.5ml)，顛倒離心管使之均勻后冰浴15min。
6) 12000×g離心20min，棄去沉淀。
7) 上清液加2倍體積的冷乙醇，-20℃放置1h以上。
8) 12000×g離心20min，棄上清液，取沉淀，真空干燥。
9) 將沉淀溶于500μl TEB(10mmol/LTris-HCl，lmmol/L EDTA，pH7.5)，加RNase至20μg/ml，37℃作用1-4h，以除去RNA。
10) 加等體積的飽和酚，振蕩混勻后，10000rpm離心6min，取液相。
11) 在液相中加入等體積的酚：氯仿(1：1)，振蕩混勻后10000rpm離心6min，取液相。
12) 在液相中加入等體積氯仿，振蕩混勻，10000rpm離心6min，取液相，并加入2倍體積的冷乙醇，-20℃沉淀DNA。
13) 離心收集DNA沉淀，用70％乙醇洗滌3次，真空干燥后溶于TEB中，備用。
4. rDNA片段的制備
1) 對所得重組質粒DNA進行SacⅠ酶切，反應體系如下：SacⅠ 4μl(約20單位)，質粒DNA 50μl(20μg)，10×緩沖液(0.5mol/L Tris-HCl，pH7.5，50mmol/L MgCl2)10μl，滅菌重蒸水36μl。
2) 將反應后的混合物進行瓊脂糖凝膠電泳2-3h，在紫外燈下確定DNA片段的位置，從凝膠上切下相應DNA片段的凝膠塊。
3) 將上述凝膠塊裝入透析袋中，一端扎緊，加入450μl 0.2×TEB(10mmol/LTris-HCl，pH7.5，1mmol/L EDTA)，排除氣泡，封上另一端。放入電泳槽中進行電泳，300V電泳1.5h，反向通電1min。
4) 從透析袋中吸出溶液，再加450μl 0.2×TEB沖洗透析袋，兩次溶液合并后以12000rpm離心15min，除去凝膠碎塊。
5) 用酚、酚/氯仿、氯仿抽提后，加入2倍體積乙醇，沉淀DNA片段，再用70%乙醇洗滌并真空干燥，用TE溶解待用。
5. rDNA片段的生物素標記
本實驗用的標記方法是缺口平移法(Nick-translation)。其原理是在未標記的DNA探針溶液中加一定量的DNaseⅠ和DNA聚合酶Ⅰ以及生物素(或同位素)標記的三磷酸核苷酸。DNaseⅠ在DNA雙鏈上隨機切開若干個有3'-OH末端的單鏈切口，DNA聚合酶Ⅰ則利用標記的三磷酸核苷酸按5' -3' 方向重新修補缺口，此新合成的DNA的兩條鏈上均勻地被帶上標記物。其標記方法如下。
1) 反應體系
10×生物素反應液：0.5mol/L Tris-HCl,pH7.5，50mmol/L MgCl2。
dNTP溶液：50mmol/L Tris HCl，pH7.5，每種dNTP的最終濃度為0.3mmol/L。
生物素化dUTP溶液：Bio-dUTP溶于50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，最終濃度為 0.3mmol/L。
DNA多聚酶Ⅰ溶液；濃度為3單位/μl，溶于0.1mol/L磷酸鈉，50％乙醇，l mmol/L DTT混合液中。
DNaseⅠ溶液：濃度為0.1μg/μl，溶于10mmol/L Tris-HCl，pH7.5，l mg/ml 牛血清白蛋白混合液中。
2) 取dNTP混合液(無dUTP)5μl，10×反應液5μl，DNA 4.5μl(1μg)，Bio-dUTP 7μl，酶混合液5μl，重蒸水23.5UI。混合后反應60min，加5rd終止反應液(0.25mo1/L EDTA，pH7.5)終止反應。
3) 加入2倍體積的乙醇，沉淀DNA。
4) 用70%乙醇洗滌3次，以除盡來摻入的Bio-dUTP。
5) 真空干燥之后，以重蒸水溶解DNA，待用。
6. 對標記的rDNA進行檢測
采用硝酸纖維素膜固相雜交的方法進行檢測。
1) 將硝酸纖維素膜剪成合適大小的長條，在2×SSC(0.15mol/L NaCl，0.015mol/L檸檬酸鈉，pH7.4，等于1×)中浸泡過夜。
2) 撈出硝酸纖維素膜，空氣干燥。
3) 將標記后的探針進行適當稀釋，95℃水浴加熱2-5min，使DNA變性。
4) 將變性后的DNA探針馬上冰浴10min。
5) 將探針點在晾干的硝酸纖維素膜上，每個斑點點4μl。
6) 晾干后，將點樣的硝酸纖維素膜夾在濾紙中間，80℃烘烤2h。
7) 用0.01mol/L PBS，pH8.2洗滌3次，每次15min。
8) 將與膠體金相連的鏈霉親和素用pH8.2的PB進行稀釋，并將膜放入該液中，室溫孵育60min。
9) 用0.01mol/L PB，pH8.2洗膜3次，每次15min。
10) 顯影。
A液(對苯二酚0.85g，檸檬酸2.55g，檸檬酸鈉2.35g，水50ml)B液(AgNO3 93mg，水50ml)按1：1混勻為顯影液。將膜浸泡在顯影液中，避光顯影至出現深色斑點。用25%海波定影1-2min。
7. 1) 按電鏡常規制片程序，將用K4M樹脂包埋的玉米根、松根等材料進行超薄切片，將其撈在鎳網上。
2) 將載有切片的鎳網放在2×SSC液面上于700℃浸30min，以破壞rRNA的二級結構。另取一些切片載網，先用1mg/ml RNase處理2h，用重蒸水徹底清洗。再轉入2×SSC中，于70℃加熱處理30min作對照。
3) 在Parafilm膜上滴25μl預雜交液(50%去離子甲酰銨，10%硫酸葡聚糖，0.05%變性鮭精DNA，2×SSC)，將切片漂浮在預雜交液上，放入保濕盒內，42℃預雜交1-2h，以防止非特異性雜交。
4) 將標記的探針加熱至100℃，變性5min后馬上放入冰水中，0℃冰浴10min。
5) 在預雜交液中加入變性的探針，終濃度約為0.5μg/ml，此液即為雜交液。
6) 將雜交液滴在Parafilm膜上，將預雜交的切片漂浮在雜交液上。
7) 雜交后用50%去離子甲酰胺洗兩次，每次5min。
8) 載片鎳網依次用2×SSC，1×SSC，0.1×SSC，重蒸水各洗兩次，每次5min，空氣干燥。
9) 雜交后的切片用3%BSA(0．1mol/L PBS配制)封閉5min。
10) 將切片漂浮在金標鏈霉親和素上(金顆粒直徑為10nm，1：20稀釋)，于室溫放置1h。
11) 用PBS洗3次，每次5min，空氣干燥。
8. 電鏡檢測雜交結果
1) 用1-2%醋酸雙氧鈾染色5min。
2) 重蒸水漂洗3次，每次5min。
3) 檸檬酸鉛染色1min。
4) 重蒸水漂洗同(2)，空氣干燥后電鏡觀察。
注意事項
環境、器皿的清潔和藥品的純度是該實驗成功的關鍵。RNA容易被RNA酶水解，而RNA酶非常穩定，所以標本和藥品及器皿中應避免RNA酶的污染。
方法評論