動物染色體標本的制備與觀察

實驗概要

本實驗介紹了動物染色體標本（cell chromosome）制備的原理及操作步驟。

實驗原理

凡細胞處于活躍增殖狀態，或者經過各種處理后，細胞就可進入分裂的任何動物組織，均可用于染色體分析。在正常動物體內，骨髓是處于不斷分裂的組織之一。給動物注射一定劑量的秋水仙堿即可使許多處于分裂的細胞停滯于中期，然后采用常規空氣干燥法制備染色體，即可得到大量可分析的染色體標本。本方法簡便、可靠，不需要經體外培養和無菌操作，易于推廣。所以，骨髓細胞是用于動物細胞遺傳學研究很好的材料。

主要試劑

1. 2%檸檬酸鈉溶液：稱取2g檸檬酸鈉（檸檬酸三鈉，Tri-sodium citrate, AR）溶解于100ml蒸餾水中。
2. 1%檸檬酸鈉溶液。
3. 500μm/ml、100mg/ml秋水仙素溶液。
4. Giemsa（姬姆薩）原液（pH6.8）
Giemsa染粉 1g
甘油（丙三醇，glycerine, AR） 33ml
甲醇（methyl alcoholA, AR）  45ml
將染粉傾入乳缽，加幾滴甘油，在乳缽內研磨直到無顆粒為止，此時再將全部剩余甘油倒入，放入60～65℃保溫箱中保溫2h后，加入甲醇攪拌均勻，保存于棕色瓶中備用。
5. 0.067mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）
Na₂HPO₄·12H₂O11.81g   (或Na₂HPO₄·2H₂O 5.92g)
KH₂PO₄ 4.5g
溶解于蒸餾水中至1000ml
6. 1:10 Giemsa 磷酸緩沖液染液（pH6.8）
7. 甲醇（AR）
8. 冰醋酸
9. 0.4%KCl溶液

主要設備

1. 水平離心機

2. 顯微鏡

3. 刻度離心管（10ml）

4. 注射器（1ml）

5. 載玻片

6. 燒杯（400ml）

7. 量筒（100ml）

8. 試管架

9. 鑷子、剪刀、解剖刀、吸管等

實驗材料

小白鼠

實驗步驟

1. 動物按4μg/g體重的劑量經腹腔注射秋水仙素，3～4h后殺死動物。

2. 取出動物后肢的脛骨和股骨。剪去兩端。

3. 將0.6～1ml 2%檸檬酸鈉用1ml注射器接上5^#針頭注入骨髓腔，將骨髓細胞先沖入小碟取下注射器針頭，反復吸打骨髓細胞，使細胞團塊分散，轉入10ml離心管。

4. 視骨髓量之多寡加入0.4%KCl溶液8～10ml，隨即將離心管置37±0.5℃水浴中低滲15～20min

5. 以1000r/min離心8min

6. 棄上清液，沿離心管壁緩慢加入新配制的甲醇:冰醋酸（3:1）固定液5ml，加固定液時注意不要沖動細胞團塊。

7. 加完固定液后，立即用吸管將細胞輕輕吸打均勻，靜置固定20min。如此反復固定2～3次，每次20min。

8. 固定的細胞經離心后，吸取上層固定液，視管底的細胞多寡加入少量新配制的固定液，將細胞團塊輕輕吸打成懸液。

9. 在干凈、濕、冷的載玻片上滴2～3滴上層細胞懸液，在酒精燈上文火烘干（在空氣干燥的地方可不用）。

10. 將玻片標本平放于支架上，細胞面朝上，每片滴加1:100 Giemsa磷酸鹽緩沖液3～4ml，染色10min。

11. 在自來水管下細流沖洗數秒，去掉Giemsa磷酸鹽緩沖液，用小塊紗布擦干玻片標本底面和四周，顯微鏡觀察和分析。