實驗概要
機械力在生物過程中發揮著顯著作用。這些機械力可以通過骨架長絲網絡傳送到細胞，誘導胞漿內不同的生化反應。雖然已經有充足的報告顯示，細胞質酶可被細胞表面的局部應力直接激活，但一直沒有證據表明，機械力可以直接改變核功能，包括卡哈爾體蛋白質復合物的結構變化。本實驗描述了通過利用磁場扭曲力改變，流式細胞儀與熒光共振能量轉移（FRET）監測哈爾體蛋白質的動態變化和相互作用。
主要試劑
Coilin的CFP和YFP質粒探針,SMN，fibrillarin，Nopp140，WRAP53，SART3，SmE，SmG((Miroslav Dundr，Rosalind Franklin University of Medicine and Science，North Chicago)
mCherry-Lamin 質粒( Peter Kalab，National Institute of Health)
HeLa細胞(ATCC)
Lamin A/C -/- (LMNA-knockout) mouse embryonic fibroblast (from Colin Stewart，National University of Singapore，Singapore)
Plectin -/- mouse fibroblast (from Gerhard Wiche，University of Vienna，Germany)
二氧化碳獨立的培養基(Invitrogen公司)
膠原蛋白，老鼠尾巴得到 I型(solution，Sigma，091M7675)
Ferromagnetic 珠(Fe3O4的；直徑4.5微米)( W. Moller，Gauting，Germany or J. Fredberg，Boston，MA; magnetic beads with various surface properties are commercially available in an assortment of sizes from Spherotech，Inc.，Lake Forest，IL)
二甲基亞砜，無菌過濾(DMSO，Sigma)
胎牛血清(FBS； Hyclone)
Opti-MEM培養基( Invitrogen)
青霉素，鏈霉素(Invitrogen)
磷酸鹽緩沖液(PBS; Hyclone)
L-谷氨酰胺(100X)(Invitrogen)
脂質體2000(Invitrogen)
Trolox (6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid; Sigma)
2％的Bis 溶液(Bio-Rad Laboratories，161-0142)
40％的丙烯酰胺溶液(Bio-Rad Laboratories，161-0140)
3-aminopropyltrimethoxysilane (Aldrich，Product # 281778)
0.5％gluteraldehyde(Sigma-Aldrich，Product # G6257)
10％過硫酸銨(APS，Bio-Rad)
TEMED(Bio-Rad)
HEPES (Sigma)
磺酸基-SANPAH(Pierce，Product # 22589)
0.2μm的螢光乳膠顆粒(分子探針)
0.05M碳酸鹽緩沖液(pH 9.4; bioWORLD)
玻璃底培養皿(直徑35毫米;細胞E＆G)
12毫米圓形蓋玻片Fisher，cat. # 12-545-80)。
Synthetic RGD-containing peptide [Ac-G(dR)GDSPASSKGGGGS(dR)LLLLLL(dR)-NH2
Peptide-2000 (Telios) (18); Peptides International，Inc.，Louisville，KY]
實驗步驟
用RGD涂層磁珠：
1．將磁珠懸浮于95％的酒精中(殺菌)，然后分裝到2毫升小瓶內，每瓶含珠子1mg 。
2．打開一小瓶讓酒精蒸發。
3．加入的1.5毫升PBS緩沖液沖洗珠子。離心，并小心棄掉PBS。
4．加入1mL碳酸鹽緩沖液。
5．添加50μg RGD肽(用二甲基亞砜稀釋)到珠子緩沖液中。
6．震蕩珠，4℃過夜。
7．使用珠子前，離心，棄RGD上清，然后用PBS沖洗一次，如第3步。
8．將磁珠存儲在無血清培養液DMEM中。
細胞培養和轉染
1．實驗中使用的所有細胞都傾向于低通道。
2．常規細胞培養于T-25培養瓶中，培養液為DMEM包括： 10％FBS，100U /毫升青霉素，100μg/mL的鏈霉素，和2mM L-谷氨酰胺，37℃， 5％CO2培養箱中培養。
3．進行細胞實驗，需要提前3天準備。第1天，用膠涂滿玻璃瓶底，4℃過夜，使玻璃表面吸收的膠原蛋白。
4．第2天，將膠原蛋白涂層的培養瓶在紫外光照射下照射10分鐘消毒。細胞(?300，000)在35毫米的膠原蛋白涂層培養瓶中，第2天將達到80％融合。
5．第3天，用CFP和YFP的標記蛋白的質粒結構雙轉染細胞。稀釋1μg CFP質粒和1μgYFP質粒至100μg Opti-MEM I 培養基的小瓶內。
6．在另一個小瓶中，加入4μL脂質體2000至Opti-MEM I培養基的小瓶內。
7．將兩小瓶的內容混合在一起前，在室溫下等待5分鐘，然后再等待20分鐘。
8．加入200μl的DNA -脂質體混合物至含有細胞的培養瓶中。
9．可選：為了盡量減少漂白，加入0.05mM Trolox和DNA -脂質體混合物至培養瓶。
10．37℃，5％CO2培養箱中孵育6小時，更換培養基培養液培養。
11．第4天，細胞轉染，并準備成像
磁扭儀(MTC)：
1．在第4天，取出培養瓶棄掉大部分培養液，只有在中心(玻璃地區)的細胞被培養基覆蓋。
2．加入20μLRGD涂層的磁珠(20微克)分散使其鋪滿培養瓶中央區。
3．小心地將珠進入孵化器10分鐘，以便整合集群和周圍的珠子粘連。
4．從孵化器中拿出細胞，用PBS沖洗一次。以及避免中心的細胞分散。輕輕的加入PBS并從另一邊倒掉。
5. 當細胞置于顯微鏡下下時，為了維持細胞培養的pH值，像培養箱中加入CO2。
6. 將培養瓶放置在MTC的階段。然后將其放置在倒置顯微鏡下。
7．找到被CFP和YFP質粒轉染的單細胞，細胞也需要一個珠子與它連接。棄掉所有未轉染細胞，有一個以上的珠連接的細胞，或與相鄰細胞接觸的細胞。
8．找到良好的細胞后，運用強大的電磁脈沖(?1000G，<為0.5ms)磁化磁珠。
9．珠子被極化和磁化，利用垂直方向的磁場脈沖磁化，這將導致珠旋轉。輸入MTC的參數。FRET分析的應力峰值幅度通常為17.5Pa(50G step load)或其他的幅度，相位滯后分析為24.5Pa(70G oscillatory load)。
10．利用壓力，捕捉必要的光或熒光圖像。
共振成像分析：
1．對于共振成像，雙視角成像系統被用來分裂成兩個(1344×512每像素)的位象。頂視圖捕捉YFP，而底視圖捕捉CFP。
2．利用MTC，FRET雙視圖的時間軸圖像捕獲監視細胞核內蛋白質與蛋白質之間相互作用。
3．實驗完成后，并獲得圖像。利用Matlab程序分析數據。程序分為頂部的(YFP)和底部的(CFP)的位像。
4．選擇有效的區域(在我們的例子中的CB)，程序通過從CFP和YFP的圖像定格區域，然后通過交叉關系對齊
5．使用Matlab的“graythresh”二進制掩碼創建CFP和YFP的圖像。二進制掩碼，然后乘以熒光圖像生成的圖像，有熒光區域和黑色的背景。
6．計算CFP / YFP的比率值，每個像素已對齊和交叉相關，取得和報告的區域的平均值。每個圖像或時間點會產生一個CFP / YFP的價值。
聚丙烯酰胺凝膠牽引力的測量：
1．聚丙烯酰胺(PA)與0.2μm的熒光珠凝膠用來衡量每個細胞產生的牽引力。由雙丙烯酰胺的濃度不同，可以得到不同的凝膠剛度
2．準備PA凝膠，超過在35毫米的玻璃瓶底表面使用尖棉拭子涂抹3-aminopropyltrimethoxysilane，等待6分鐘。
3．用清水洗凈，然后加入100μL/每瓶 0.5％ gluteraldehyde，靜止30分鐘。
4．徹底清洗一遍，干燥。整個凝膠避免接觸玻璃表面。
5．判斷之二：丙烯酰胺溶液的比例，以獲得所需的凝膠的剛度。0.6，2和8 KP，0.06％的雙丙烯酰胺和3％的丙烯酰胺，0.05％雙丙烯酰胺和5％的丙烯酰胺，0.3％的雙丙烯酰胺和5％的丙烯酰胺分別對應。在2毫升小瓶內準備1毫升每個所需的混合物。
6．加入10μL的0.2μm的熒光珠至雙丙烯酰胺的混合物。加入熒光珠之前，請務必渦流或超聲粉碎。
7．加入聚合激活物/啟動子至珠雙丙烯酰胺的混合物。10％APS 體積比為1：200(在這種情況下，5μL)TEMED體積比為1：2000(在這種情況下，0.5μL)。徹底混合在一起。
8．加入15μL混合物到處理玻璃瓶的表面。(15μL將給予75μm 厚的基板)。
9．12mm 的圓形蓋玻片壓平。
10．轉動的玻璃底部盤，使其倒掛。這可以確保熒光珠接近頂面。
11．放入培養箱孵育30-45分鐘。高溫有助于在聚合。
12．凝膠完全聚合后，用100mM的 HEPES沖洗。 的菜肝素鈉。然后單刃剃須刀小心地移走圓形玻璃蓋。
13．制備1mM的SANPAH溶液，含二甲基亞砜和100mM的 HEPES。添加二甲基亞砜到SANPAH先溶解固體粉末，然后將它添加到 HEPES 。
14．從玻璃瓶底吸出HEPES，用金濕巾吸取周圍凝膠邊緣。
15．應用200μL SANPAH溶液凝膠。
16．暴露表面于紫外線下6分鐘(離燈6“)激活凝膠表面。SANPAH顏色會轉暗，沒有SANPAH處理，膠原蛋白不會綁定到凝膠表面。
17．用100mM的 HEPES沖洗掉SANPAH。
18．再次重復照片激活和沖洗過程，不少于一次，用100mM的 HEPES沖洗。
19．凝膠表面用所需濃度的膠原蛋白涂抹，4℃孵育過夜。
20．將細胞接種于凝膠表面前，在紫外光下消毒10-15分鐘。
21．PA凝膠可4℃存儲在PBS中三個星期。
注意：要確定所需的基板剛度與雙丙烯酰胺的比例，參考文獻23-25。
牽引力顯微鏡(TFM)：
1．細胞培養在PA凝膠上。根據PA凝膠剛度，細胞會產生不同的牽引力，從而不同程度的變形。
2．需要捕獲三幅圖像。首先是用于識別細胞邊界的光學或相襯圖像。二是熒光磁珠標記的圖像，細胞仍然是在基板上。三是參考熒光磁珠標記的圖像，從凝膠表面的細胞已被移除或胰酶消化。
3．一個自定義的Matlab程序來分析產生的牽引力。通過比較熒光珠位置前和胰蛋白酶消化后，確定由每個體細胞的牽引力引起的位移場。
4．其中flourecent圖像劃分成小窗口區域用來確定位移向量。
5．基于Boussinesq液，利用Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC) 的均方根(RMS)的牽引場，計算出位移場。
細胞剛度測量：
1．應用細胞壓力(Pa)計算扭轉磁場(G)，乘以常數(PA / G)和應用的珠扭場(G)。珠常數反映珠的磁屬性和批次，批次可能會有所不同。他們浸泡在一個已知的粘性液體，并申請一個恒定的磁場，同時測量殘余的磁場。例如，一個50 G對細胞產生17.5帕的壓力，如果細胞珠常數為0.35 PA / G9。
2．當在顯微鏡下觀察到頂端附著磁珠的細胞，MTC的震蕩應力為0.3 Hz。
3．MTC軟件跟蹤磁珠的位移坐標，并保存在一個文本文件。
4．通過量化磁珠位移和磁珠嵌入領域，細胞的復模量可被估計。用自定義的Matlab程序，計算細胞的剛度。
5．磁珠的位移波同步的選擇輸入正弦信號，篩選出珠子或顯微鏡位移轉變的自發運動。
6．磁珠位移小于5 nm(檢測結果)和松散結合的磁珠未被選擇進行分析。為了增強信號噪音比，位移的峰值幅度超過每個細胞5個連續周期。
7．應用方程G * = T / D計算復雜的剛度。對于每個珠子，根據相位滯后計算彈性剛度G、(G*的實部)和耗散剛度G”( G *的虛部)。測量剛度為扭矩單位每單位珠位移(PA /納米)。
8．基于細胞表面接觸珠，用有限元模型轉換細胞剛度(PA /納米)至模量(PA)。(如圖1)
9．關于如何計算剛度的更多細節已被 Fabry Bet. 等描述。
相位滯后量化：
1．振蕩應力(0.3 Hz或0.83 Hz)應用于較好轉染的細胞，類似于用來測量細胞剛度應力。
2．磁珠的時間位移，捕獲CFP標記蛋白，YFP標記蛋白時，應用循環應力。
3．自定義的Matlab程序用于分析圖像和珠位移，決定CFP和YFP的標記蛋白質。計算磁珠熒光蛋白的相位滯后。
4．應力的一個完整的周期為為3600。例如，在0.3赫茲，一個完整的周期時間是3.33s。如果CFP落后磁珠0.3秒，將對應的320相位滯后。
均方位移(MSD)：
1．對于CB動力學，應用振動應力(0.3 Hz)。使用單一視圖熒光過濾器，獲得熒光圖像用于MSD的分析。
2．磁珠的時間位移， CFP標記蛋白，YFP的標記蛋白被捕獲之前，利用期間和之后的循環應力。
3．通過使用“graythresh”Matlab函數得到珠子的二進制圖像，CFP和YFP。然后得到珠子和熒光蛋白的質心坐標。
4．獲得每個熒光粒子的坐標，然后用來計算Coilin的MSD和SMN。
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