MTT比色法實驗原理、步驟及注意事項

實驗概要

MTT全稱為3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。本實驗介紹了MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。

實驗原理

MTT檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。

缺點：由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。

主要試劑

1. MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。
2. 配制MTT時用PBS（pH=7.4）溶解。

PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g調pH7.4，定容1L。

實驗步驟

普通MTT法實驗步驟：

1. 接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞（細胞濃度的問題見后面的注意事項）接種到96孔板，每孔體積200ul.

2. 培養細胞：同一般培養條件，培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。

3. 呈色：培養3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)10ul.繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加100ul DMSO，振蕩10min，使結晶物充分融解。

4. 比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線

藥物MTT法實驗步驟：

貼壁細胞：
1. 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細胞調密度1000- 10000 /孔，（細胞濃度的問題見后面的注意事項）。

2. 5%CO₂，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午）加藥.一般5-7個梯度，每孔100ul，設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況

3. 5%CO₂，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。

5. 終止培養，小心吸去孔內培養液。

6. 每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7. 同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜）。

懸浮細胞：

1. 收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×10⁶/ml（細胞濃度的問題見后面的注意事項），按次序將①補足的1640（無血清）培養基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）

2. 置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）

4. 離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。

 5. 同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。

注意事項

1. 選擇適當得細胞接種濃度和培養時間。

2. 設置調零孔（只加培養基100ul、MTT10ul、二甲基亞砜100ul）。

3. 設置空白孔（細胞、藥物溶解介質、培養液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亞砜）。

4. MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系。

5. 96孔板邊緣32孔用無菌PBS填充，因為邊緣的32孔中水分蒸發很快，藥物易被濃縮，對實驗影響大。同時加入PBS液填充后，可以一定程度上保持中間孔的水分。

6. 防止藥物與MTT反應。

如果96孔板中加入了具有氧化還原性的藥物，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建議用PBS將細胞洗洗，否則這些藥物會將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是不需要的。

7. 吸收值分析

在理想的MTT實驗中，如果是細胞抑制實驗，不加藥物處理的空白組的吸收值應該在0.8-1.2左右，太小檢測誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經超出線性范圍。這個原理在朗伯-比爾定律中有解釋。

8. 培養過程中換液

100ul的培養液對于10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持50h以上，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果。如果培養時間長，在48h應該換液一次。

9. 避免血清干擾

高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養液進行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。

10. 判斷污染

如加入MTT后都有個別孔立即變為藍黑色，則污染的可能性極大。在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。

11. 加DMSO前要把液體小心吸掉

但培養液里的紫色結晶可能會吸去，可在這之前先用平板離心機離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細胞，則推薦此法，懸浮細胞要離心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板，清除上清時注意不要把下面的結晶顆粒吸掉。對于貼壁細胞，可以試著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸。
12. MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。MTT一般最好現用現配，過濾后4ºC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉。