間接乳膠凝集試驗

實驗概要

本文以炭疽為例介紹了間接乳膠凝集試驗(indirect latex agglutination test)的原理及操作流程。

實驗原理

所用乳膠系人工合成的聚苯乙烯乳膠，它是由0.6～0.7μm球形小顆粒組成的膠體溶液，該膠體溶液對高分子蛋白之類的物質具有良好的吸附性能。故在試驗時，以其為載體，將炭疽抗體球蛋白吸附在乳膠顆粒表面上，制成所謂的炭疽乳膠診斷血清，當與特異抗原相遇時，乳膠顆粒即被動凝集在一起，在液滴中形成肉眼明顯可見的乳膠凝集塊，即為陽性反應，如仍為均勻混濁的乳狀懸液，則為陰性反應。

主要試劑

聚苯乙烯乳膠、炭疽高免血清、炭疽芽胞抗原、pH值7.2 PBS、pH值8.2 硼酸緩沖液等。

實驗步驟

1. 乳膠致敏前的處理：乳膠在致敏前，進行預處理的目的是為了增加乳膠的穩定性，提高其吸附力，減少非特異性凝集。通常按下述方法處理。

取10%乳膠原液1ml，加雙蒸餾水4ml稀釋成2%，再加pH值8.2 BBS(即硼酸緩沖鹽水，由Na₂B₄O₇?H₂O 66.7g，H₃BO₃80.4g，NaCl8.5g溶于1000ml雙蒸餾水中制成)12ml、1%胰酶溶液(用pH值8.2 BBS配制)2ml，充分混勻，置45℃水浴槽中作用13h，以10000 r/min離心30min，棄去上清，往沉積的乳膠中加入pH值8.2 BBS 10ml，輕輕搖勻，即為1%乳膠懸液。

2. 致敏乳膠血清的制備：以pH值7.2 PBS將炭疽高免血清稀釋成1∶20后，在56℃水浴槽中作用30min，取0.2ml緩慢地滴加于1%乳膠懸液1ml中，滴加血清時要邊加邊振搖，以促進吸附，然后將其置于56℃水浴槽中致敏2h，中間搖動2～3次，再置室溫下穩定4h即成。為使致敏的乳膠能長期保存，可加0.1%硫柳汞防腐，置4℃冰箱中保存，其有效期不少于一年，但應注意，絕不能凍結。

對照乳膠正常血清，系以健馬血清按上述方法處理乳膠懸液制成。以上兩種乳膠血清眼觀都呈均勻的乳狀，在顯微鏡下檢查，見懸液中有許多均等散在的球狀小顆粒，絕無自凝現象，與0.2%NaCl溶液混合時，也不發生凝集。

3. 操作方法：用1ml吸管吸取被檢標本液往玻板上分別滴加二滴，每滴0.1ml，再用另1支1ml吸管吸取標準炭疽抗原，也往同一玻板上的另一側分別滴加二滴，每滴也為0.1ml，再用2支吸管分別往標本滴及炭疽標準抗原滴中滴加炭疽乳膠血清及正常乳膠血清各0.05ml后，用小木棒把上述四個滴液混合均勻，靜置于室溫下，于5min內按以下標準判定結果。

注意事項

1. 乳膠性質脆弱，易受各種理化學因素的影響發生自凝現象，失去使用價值。為阻止試驗中乳膠自凝現象的發生，提高對免疫血清的吸附力，減少制成的乳膠產生非特異性反應，所用乳膠懸液，一律用胰酶處理后再作試驗。需要注意的是，處理過的乳膠懸液不能久放，超過3天后應用，吸附血清的能力明顯下降。

2. 制備乳膠炭疽血清時，免疫血清的用量必須嚴格優選，用量過大，如1∶10時，會一定程度地抑制乳膠炭疽血清與特異抗原發生反應，用量過小，不但自身凝集，而且與鹽水對照也發生凝集。

3. 被檢抗原的處理方法，可直接影響乳膠炭疽血清的檢出率。以煮沸殺菌法處理標本較簡單，且對結果影響較小。