酵母的轉化及突變體的透射電鏡觀察

實驗概要

本實驗制備了酵母感受態細胞，轉化細胞在以葡萄糖為碳源的SD培養基中誘導后，對突變體進行了透射電鏡觀察。

主要試劑

SD培養基配方:

12 g/L NaOH；

20 g/L琥珀酸(Succinnic acid )；

事先將這兩種藥品溶解，再加下述藥品；

1.7 g/L，無硫酸銨的酵母氮源(Yeast Nitrogen Base (YNB) )；

加入必需氨基酸至0.004%；

若需要，加入腺嘌呤、尿嘧啶至0.002%；

1g/L硫酸銨；

20 g/L碳源(葡萄糖或半乳糖)；

若配置固體培養基，加入20 g/L瓊脂粉；

滅菌20-30 min。

實驗步驟

1. 酵母感受態制備及轉化

參照Clontech公司的酵母操作手冊進行。

   1) 挑取幾個直徑在2-3 mm的新鮮酵母克隆，接種到lml SD培養基中，劇烈震蕩5min以使細胞團塊分散均勻；

   2) 轉入50mI SD培養基中，30℃，250rpm過夜培養16-18h，使細胞生長狀態達到穩定期(OD₆₀₀> 1.5 )；

   3) 用SD培養基稀釋過夜培養物，使酵母細胞液OD₆₀₀為0.2-0.3；

   4) 30℃，250rpm繼續培養3h左右，至OD₆₀₀為0.4-0.6；

   5) 將細胞轉入50mI離心管中，室溫，1000g，離心5min；

   6) 棄上清，用無菌超純水重懸起細胞沉淀，合并于同一個離心管中；

   7) 室溫下，1000g，離心5min，棄上清；

   8) 用1.5ml新鮮制備的1 X TE/1 X LiAc重懸，即為酵母感受態細胞；

   9) 將0.1 ug質粒DNA及0.1ug蛙精DNA加入1.5ml的Ep管中充分混勻；

   10) 加入0.1 ml酵母感受態細胞，振搖混勻；

   11) 加入0.6ml PEG/LiAc溶液(每lml PEGILiAc中含有：800ul150% PEG，100ulLiAc，100ul I0XTE)，反復吸打混勻；

   12) 30℃，200rpm培養30min；

   13) 加入70ulDMSO，輕輕顛倒混勻；

   14) 42℃水浴熱擊15min；

   15) 冰上放置1-2min；

   16) 室溫下，14000rpm離心5s，棄上清；

   17) 用0.5mI無菌1 X TE重懸細胞；

   18) 取100ul重懸細胞涂布于含有合適SD培養基的平板上，用滅菌玻璃珠均勻涂布；

   19) 平板于30℃溫箱中倒置培養約2-4天。

2. 酵母表型誘導

挑取4-5個單克隆接種于SD培養基(以半乳糖為碳源)中，過夜培養；1000g，離心5min，收集細胞沉淀，轉入以葡萄糖為碳源的SD培養基中誘導細胞，30℃，250rpm培養l0h。

3. 透射電鏡觀察

   1) 1000g，離心5min，收集細胞沉淀；

   2) 將組織塊放入2.5%戊二醛固定液中，4℃下固定24h；

   3) 用0.1 M磷酸緩沖液沖洗3次，每次20min；

   4) 1%餓酸中室溫下固定2h；

   5) 0.1M磷酸緩沖液沖洗3次，每次20min；

   6) 50%-70%-80%-90%-100%-100%系列梯度丙酮脫水，每次20min；

   7) 812樹脂包埋；

   8) 鉆石刀、LKB- V型超薄切片機切片，TEM觀察、照相。