實驗概要
人晶狀體上皮細胞原代的和永生化細胞培養是為了一個能夠調查研究人類晶狀體上皮生理及白內障的模型系統而建立的。
人晶狀體上皮細胞培養是靠分離來自進行早產兒視網膜病變治療的嬰兒晶狀體上皮碎片，并且允許上皮細胞從外植體生長。通過使細胞培養感染腺病毒(Adl2-SV40)來達到細胞永生化。
實驗步驟
1. 原代培養
人類晶狀體是在24小時內獲得的，來自5至12個月大的接受早產兒視網膜病變治療的病人。在晶狀體囊的后部切一小部分，用眼科鑷夾持，切下的晶狀體囊和相連的上皮放入一個60mm組織培養皿。這個上皮被切成2-3部分，每部分分裝在單獨的培養皿中，加入3mLDMEM培養基(含有20%胎牛血清以及50μg/ml慶大霉素)。在37°C， 5%CO2的培養箱中培養，每周換2次培養基介質。定期使用尼康血滴比色法相差顯微鏡檢查，并且用35mm Nikon N2020 照相機拍攝。
2. 病毒感染
在原代培養完成融合后，細胞使用含EDTA的胰蛋白酶消化后繼續培養。60%融合后，進入第三階段的培養，細胞按1：10用Adl2-SV40 病毒感染并培養24小時。這時，去掉培養基介質，添加10ml新的培養基介質。細胞生長1周并以5~10 ×104每100mm的密度繼代培養。細胞進行常規計數。
細胞病變效應分析用來記錄培養基中的晶狀體上皮細胞的感染程度。0.1ml的晶狀體上皮細胞培養介質在培養3天后去掉，在六壁組織培養皿中的Vero細胞要在此條件下暴露24小時，并且濾掉殘渣。在21天時，如果Vero細胞死亡，這個培養就被叫做制造者。早期的晶狀體上皮細胞傳代(上升到10)產生能夠釋放病毒進入培養介質的細胞系。這個介質對Vero細胞具有毒殺性。經過長期的傳代，這些晶狀體上皮細胞變成了病毒的非產生者。用1:1000稀釋度的Adl2-SV40病毒進行控制測試表明病毒在同一條件下殺死了Vero細胞。
3. 超低溫冷凍法
每一代細胞用酶從培養皿上除去，懸浮在冷凍介質(DMEM含20%胎牛血清和10%DMSO，或者含5%的胎牛血清)，分裝(每個冷凍小瓶1~2×106個細胞)，以每分鐘下降1℃的速度進行冷凍，并保存在液氮中。
4. 永生細胞的增殖
為了判定被感染細胞的增殖能力，50,000個細胞被裝在60mm的盤子里(每個時間點3次復制)，用庫爾特計數器進行細胞數量計數。生長鑒定需在生長了10天以上的時候進行，這時培養是融合的。
5. 數量倍增水平
用以下方程式，計算這個水平
Nf/N0 = 2×(1)
x=數量倍增值，Nf = 細胞最終數量，N0 = 最初接種于培養皿的細胞數量。
x = log (Nf/N0)/log 2。每次傳代后，x 就被加到之前的數量倍增值以獲得新的值。
6. 免疫組織化學
細胞被放入24孔板中，生長到60%融合時，用1m70%乙醇固定。加入200μl 的0.05 M Triscl，PH為7.4(洗滌緩沖)，細胞用一級抗體(單克隆鼠IgG為SV40抗原)以1:20稀釋度培養1小時，用洗滌緩沖三遍后，細胞用二級抗體(免疫學抗體)室溫培養15分鐘，細胞像剛才一樣洗滌緩沖，之后用抗生物素蛋白過氧化物酶培養1.5分鐘，洗三次，用新鮮基質(二氨基聯苯胺)處理15分鐘。經過大量的沖洗，細胞在洗滌緩沖中含水，相位差顯微鏡下觀察。
7. SDS-PAGE和免疫印跡
細胞在4°C是溶解，10,000離心，上清液用最初的抗體進行處理。細胞用瓊脂糖偶聯G蛋白進行免疫沉淀，免疫復合物通過離心方法收集，用裂解緩沖液進行沖洗，并停留在200 μl SDS-PAGE 含有50mM Tris-cl緩沖液中，PH為6.8，2% SDS，1% 二巰基乙醇，10%的甘油以及0.1%的溴酚藍。根據Laemml，用10%的丙烯酰胺凝膠進行電泳。在硝酸纖維素膜進行免疫印跡后，用同一個抗體和125I-labeled protein A對印跡進行探查，并且暴露在Kodak XAR film下1至7天。對β晶狀體的多克隆抗體從含有純化幼齡晶狀體βH-晶狀體免疫兔子上獲得。對人類γ-晶狀體抗體是通過來自幼兒的晶狀體單體蛋白組分免疫兔子獲得。幼獸的γ-晶狀體抗體是通過用幼獸γ-晶狀體免疫兔子獲得。
8. 同工酶表型以及染色體核型分析
同工酶和染色體分析是由來自密歇根州底特律的兒童醫院Joseph Kaplan博士進行研究的。物種鑒定以及表型頻率的計算是用乳酸脫氫酶(LDH)、葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PDH)、葡糖磷酸變位酶1(PGM1)、酯酶D(ESD)、蘋果酸酶、線粒體(Me-2)、腺苷酸激酶(AK-1)以及乙二醛- 1((GLO-1)進行。染色體計數是用100個中期分裂決定，以及9 Giemsa帶核型決定。