實驗概要
高親和力鉀離子(high-affinity K)轉運體基因家族是植物中最大的鉀離子轉運基因家族，在植物的生長發育中起著重要的作用。本研究中通過全基因組搜索，在水稻基因組中發現27個基因編碼高親和力鉀離子轉運子。通過系統發生樹將擬南芥與水稻的HAK轉運子基因家族分成4個相互獨立的亞族。在單子葉和雙子葉植物分離之后，水稻中的HAK基因按照種系特異性的方式進行了擴張對該基因家族的功能性分歧分析表明該家族的亞族之間發生了功能性分歧現象。對該基因家族的適應性進化分析表明具有正選擇效應的點突變和基因轉換事件在該基因家族的進化過程中起到重要作用。
實驗步驟
1. 基因組水平上水稻HAK轉運體基因的鑒定
擬南芥中已經被確認存在13個擬南芥HAK轉運子基因。本研究中從GenBank數據庫中獲得這13基因編碼的蛋白質序列(見表)。為獲取水稻的HAK基因，本研究首先利用Blastp搜索了TIGR水稻基因組注釋數據庫，水稻基因組計劃(theRice Genome Project，RGP)數據庫和NCBI數據庫，對這些數據庫的搜索利用的是擬南芥HAK轉運體蛋白作為檢索序列(見表)。如果檢索出的蛋白質序列滿足E≤10-10，將被作為候選序列。其次再利用Pfam軟件鑒定所有的候選蛋白序列中是否存在K十轉運體結構域，若存在該結構域，將被作為HAK轉運體。新鑒定出的HAK蛋白序列被作為檢索序列重新進行上述操作，直至沒有新的序列檢出為止。水稻中HAK基因的核苷酸和蛋白質序列來自于TIGR數據庫。利用這些基因的編碼序列(CDS)為檢索序列，通過Blastn檢索Knowledge-Based Oryza MolecularBiological Encylopedia數據庫(KOME， http://red.dna.affrc.go.jp/cDNA/)，以獲得這些基因的全長cDNA序列。同時利用水稻HAK基因的編碼序列檢索NCBI的EST數據庫以獲得與目標基因相匹配的EST序列。
2. 序列分析
1) HAK轉運體蛋白質序列的多序列聯配利用Clustal X 1.83軟件進行，參數為默認。將多序列聯配結果輸出至MEGA 4軟件中，并利用MEGA 4構建系統發生樹，方法為鄰接法(neighbor-joining，NJ) 最小進化法(minimum evolution，ME)和極大吝嗇法(maximum parsimony，MP)，并利用bootstrpping法對構建的系統發生樹進行評估。系統發生樹的顯示同樣采用MEGA軟件。
2) 為評估該基因家族組間的功能性分歧，利用DIVERGE軟件計算亞族間的I型功能性分歧系數e和似然比測驗統計數。似然比測驗統計數近似服從于1個自由度的卡方分布。顯著高于0的e值表明在基因復制之后可變選擇壓力作用于一些氨基酸位點。
3) 核苷酸的非同義替換率(dN)和同義替換率(dS)的比值(dN/dS)是衡量選擇壓力的分子進化參數，通常用ω表示。ω> 1表示正選擇壓力(positiveselection)；ω < 1表示純化選擇壓力(purifying selection)；而ω=1表示中性選擇或自然選擇壓力(neutral selection)。本研究中利用PAML 4軟件包中的codeml程序計算水稻每亞族HAK基因的ω。根據系統樹和序列對位排列結果，采用“位點特異性”模型(site-specific model)下的各種密碼子替換模型來計算每個位點上的ω。似然比測驗(LRT)可以用于比較嵌套間差異的顯著性，前提是似然比的比較結果基本遵循卡方分布，其自由度為兩個模型間自由參數之差。在本研究中采用M3(離散模型)對M0(單個ω)模型檢驗位點間是否存在選擇壓力的差異；并用M8對M7模型檢驗正選擇壓力。M7和M8模型均采用離散β分布來估計每個位點的ω值，并通過參數P和q來描述刀分布，M8和M7的不同之處在于M8添加了一類ω>1的位點，可用于檢驗正選擇。若M8對M7的統計檢驗達到顯著水平，并且M8模型具有ω>1，再通過貝葉斯方法估計經歷正選擇作用的位點。
4) 組內基因間的序列交換檢驗采用Geneconv1.81程序，參數為默認。P<1表示具有統計意義的基因交換事件。
3. 水稻HAK基因的擴張模式分析
已有研究表明，大部分基因家族在植物中出現了成員數目擴張的現象。植物基因家族的擴張主要有三種模式，即串聯重復、片段重復和逆轉錄轉座及其他轉座事件。本研究中對HAK基因家族的擴張主要考慮了片段重復和串聯重復兩種模式。首先，根據Gramene對水稻基因組的注釋結果，將水稻所有的HAK基因定位在染色體上，將2個或2個以上緊密相鄰的HAK基因定義為基因簇(cluster)，即串聯重復基因。為鑒定起源于片段重復的HAK基因，我們對Mather的方法進行了改進。首先我們在系統發生樹上鑒定出水稻的旁系同源基因。其次我們分別查找到這一對旁系同源基因上游和下游各10個編碼蛋白質的基因，該項是根據Gramme數據庫的注釋結果進行的。最后，通過Blast分析這一對旁系同源基因的上游和下游是否存在其他的旁系同源基因，若還存在其他的旁系同源基因，則表明這對HAK同源基因起源于片段重復事件。