畢赤酵母LiCl轉化方法

實驗概要

本文介紹了畢赤酵母LiCl 轉化方法。該程序是電轉化的替代方法。轉化效率為10²-10³cfu/ug線性化DNA。

主要試劑

溶液準備：不能用醋酸鋰，一定要用氯化鋰

1. 用無菌去離子蒸餾水配制1M LiCl，過濾除菌，用無菌水稀釋

2. 用無菌去離子蒸餾水配制50%PEG(3350)，過濾除菌，存于蓋緊的瓶中

3. 用TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA)溶解2mg/ml 變性斷裂鮭魚精DNA，存于-20度

實驗步驟

1. 細胞準備：

   1) 在50mlYPD 中培養畢赤酵母至OD600＝0.8-1.0(約10⁸個/ml)。

   2) 收集細胞，用25ml滅菌水洗滌，室溫1500g離心10min。

   3) 去除水，用1ml 100mM LiCl 重懸細胞。

   4) 將細胞懸液轉至1.5ml 離心管中。

   5) 最大轉速沉淀細胞15s，用吸頭吸去LiCl。

   6) 在400ul 100mM LiCl中懸浮細胞。

   7) 將50ul細胞懸浮液移到1.5ml離心管中，每次用一管，現做現用，不要置于冰上或-20度保存。

2. 轉化：

   1) 煮沸單鏈DNA 5min，快速放于冰水中使變冷，后置于冰上。

注意：載體DNA不需要在每次用之前都煮，在-20 度保存等份少量樣品，每次解凍一管，用3-4 次后再煮。

   2) 取上面第7步中細胞，離心去除LiCl。

   3) 每個轉化樣品，按順序加入下列試劑，PEG 可保護細胞免受高濃度LiCl的有害作用240ul 50%PEG，36ul 1M LiCl，25ul 2mg/ml 單鏈DNA，溶解于50ul滅菌水中的質粒 DNA(5-10ug)。

   4) 劇烈渦旋細胞沉淀至完全混勻(1min)。

   5) 在30 度孵育30min(不要搖動)。

   6) 在42 度水浴熱擊20-25min。

   7) 6000-8000rpm離心，將轉化溶液轉移走。

   8) 用1ml 滅菌水重懸細胞沉淀。

   9) 在RDB或MD 平板上涂25-100ul，在30 度孵育2-4天，篩選轉化子Mut 表型及遺傳霉素高抗性克隆。