重組畢赤酵母的表達

實驗概要

本文介紹了重組畢赤酵母目的基因表達的方法及條件，為畢赤酵母表達因素給予指導，但對于任何表達系統，最優化條件因表達蛋白的特征而不同。

實驗步驟

1. Mut 胞內或分泌表達：為檢測表達條件是否有效，可培養GS115β-gal (Mut )(胞內表達-半乳糖苷酶)。親代載體轉化GS115 或KM71 作為胞內表達背景對照。

   1) 挑取單克隆，接種至25mlMGY，BMG或BMGY中，(250ml搖瓶)，28-30度，250-300rpm搖至OD600=2-6(對數生長，大約16-18小時)。

   2) 室溫1500-3000g離心5min，收集細胞，去除上清，用MM，BMM或BMMY重懸細胞至OD600=1.0，進行誘導表達(大約100-200ml)。

   3) 在1L搖瓶中加入上述培養物，加蓋兩層滅菌紗布或干酪包布，放入搖床繼續生長。

   4) 每24小時，加甲醇至終濃度為0.5%以繼續誘導。檢查培養基的量，確保正確加入甲醇，因為蒸發作用會減少培養基的體積。

   5) 在下列的各個時間點，取1ml培養基至1-5ml離心管。這些樣品用于分析表達水平及確定誘導后收集細胞的最佳時間。室溫用水平離心機最大轉速離心2-3min。時間點：0，6，12，24(1天)，36，48(2 天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

   6) 分泌表達時，將上清轉移至單獨管中，將上清及細胞沉淀存于-80度直至開始檢測。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍胞內表達時，去除上清將細胞沉淀存于-80度，直至開始檢測。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍。

   7) 用考馬斯亮藍染色SDS-PAGE，western blot 或功能分析方法來分析上清及細胞沉淀的蛋白表達。

2. Muts胞內或分泌表達：可培養GS115 Ablumin (Muts，分泌白蛋白至培養基中)檢測培養條件的效率。記住要用轉化親本載體的GS115 或KM71 作為胞內表達的背景對照。

   1) 挑取單克隆，接種至含100mlMGY，BMG 或BMGY的1L隔板搖瓶中。在搖床中28-30度，250-300rpm生長至OD600=2-6(約16-18小時)。

   2) 室溫1500-3000g離心5min收集細胞，去除上清，用1/5-1/10原培養基體積的MM，BMM或BMMY 重懸細胞(約10-20ml)。

   3) 置于100ml隔板搖瓶中，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住瓶口，放入搖床繼續培養。

   4) 每隔24小時，加入甲醇至終濃度為0.5%以繼續誘導。

   5) 在下列的各個時間點，取1ml培養基至1-5ml離心管。這些樣品用于分析表達水平及確定誘導后收集細胞的最佳時間。室溫用水平離心機最大轉速離心2-3min。時間點：0，6，12，24(1天)，36，48(2 天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

   6) 分泌表達時，將上清轉移至單獨管中，將上清及細胞沉淀存于-80度直至開始檢測。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍胞內表達時，去除上清將細胞沉淀存于-80度，直至開始檢測。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍。

   7) 用考馬斯亮藍染色SDS-PAGE，western blot 或功能分析方法來分析上清及細胞沉淀的蛋白表達。

3. SDS-PAGE分析：

任何標準SDS-PAGE 儀器及程序均可用，如12%聚丙烯酰胺凝膠，5%濃縮膠用于分離40-100kDa蛋白。樣品準備：需要準備Breaking 緩沖液(P60)及酸洗0.5mm玻璃珠。

細胞洗滌準備：(胞內或分泌表達)

   1) 快速融化細胞沉淀，置于冰上。

   2) 每1ml樣品，加入100ul裂解緩沖液(細胞 上清)。

   3) 加入等量的酸洗玻璃珠(0.5mm)，通過置換來估算相等體積。

   4) 渦旋30s，冰上孵育30s，重復8次。

   5) 4度最大轉速離心10min，將上清轉移至干凈的微量離心管中。

   6) 取50ul上清(細胞裂解物)，加入50ul 2×SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液(樣品buffer)。

   7) 煮沸10min，每孔加10-20ul，依膠的厚薄及孔量，決定點樣量。剩下樣品存于-20 度，用于western blot。細胞裂解物存于-80度用于分析。