實驗概要
本文介紹了冷凍蝕刻免疫電鏡技術，包括：冷凍蝕刻表面標記免疫電鏡技術和斷裂—標記免疫電鏡技術。
實驗原理
冷凍蝕刻法(Freeze Ftching)，也稱冷凍復型法(Freeze Replica)或冷凍切斷(Freeze Fracture)，是研究生物膜結構的重要方法之一。其主要步驟首先是將樣品在液氮中冷凍，然后放到真空噴鍍儀中切斷，切斷后的切面上有細胞器，其間還有凍成洋的水分。再加熱使冰升華，將水份蒸發，把細胞器的膜結構暴露出來，這一步驟就稱為冷凍蝕刻。如不進行蝕刻就稱為冷凍切斷。向暴露的膜結構上噴鍍鉑—碳投影，再噴碳來加固。這樣就在切斷的樣品表面形成一層復型膜。在此復型膜上印下了細胞切面的立體結構。從真空中取出樣品，把復型膜下面的組織腐蝕掉，再把復型膜撈在銅網上，在透射電鏡下觀察復型膜。
關于生物膜的分子結構，目前被大家公認的并為冷凍復型電鏡觀察所證實的是流動鑲嵌型，即脂質—球狀蛋白質鑲嵌模型。依照這上模型學說表明，生物膜是一種流動的、可塑的、鑲嵌蛋白質分子的脂質雙分子層的膜；脂質雙分子層中每一分子分別具有兩極，一端為親水極，朝向膜的內、外表面，而另一端的疏水極朝向膜的中線部位，兩排分子彼此相對，構成生物膜膜性結構的基礎。蛋白質分子彼此相對有嵌入性和表在性兩種，前者大約占蛋白質總量的3/4左右，外形近似球狀，鑲嵌在脂質分子層的不同深度內，而后者則大多附著于細胞膜的胞質面。在冷凍劈裂后，生物膜的水平斷面大多發生在單位膜的疏水極。因此，膜的親水部，分別命名為PS(與細胞質，核質或線粒體內基質相鄰的面)和ES(與細胞外間隙或細胞內間隙或細胞內間隙相鄰的面，如內質網腔、核質間隙、線粒體內、外膜之間的腔和其它各種泡的腔等)。膜的疏水部、亦即劈裂面分別叫做EF(面向細胞質、核質、或線粒體基質的面)和PF(向細胞外間隙或內間隙的面)。從70年代初期開始，冷凍蝕刻免疫電鏡技術已開始在應用，但由于免疫標記必須在冷凍蝕刻步驟以前進行，所以僅能標記細胞外表面(ES)。80年代開始建立了斷裂—標記細胞化學方法，將細胞膜劈開后，中央的兩側斷面(EF與PF)以及各種細胞器的膜的各個表面及細胞質與核質都能被標記，為此技術的廣泛應用創造了條件。應用此法還可對抗原與受體分子進行定量統計。
實驗步驟
1. 冷凍蝕刻表面標記免疫電鏡技術
1) 新鮮或固定的細胞進行直接法或間接法免疫標記。
2) PBS(pH7.5)沖洗3min×2，加入1mmol/l MgCl2蒸餾水洗洗3min×3，離心沉集細胞。
3) 將細胞團置于小紙板上，入液氮冷卻的Freon中，取出入冷凍蝕刻儀中進行斷裂操作，再于-100℃蝕刻1min 。
4) 制做斷裂面復型。
5) 再次氯酸鈉清洗復型，蒸餾水洗后進行觀察。
本法可顯示斷裂暴露的PF位于中央，周圍則是蝕刻后露出來的ES，標記物只出現在ES上。
2．斷裂—標記免疫電鏡技術
此法是先進行冷凍斷裂，再做免疫標記，從而可以對斷裂開的各種膜結構及胞漿斷面進行標記。
1) 臨界點干燥法
a. 固定：1.0%～2.5%戊二醛PBS液4℃1～2h，PBS沖洗3min×3。
如為細胞懸液，可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝膠化，將凝膠切成2mm左右的小塊，用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷卻的Freon中冷卻。
b. 冷凍斷裂，將冰凍的凝膠小塊放在盛有液氮的培養皿中，培養皿放置于二氧化碳—液氮槽中，用預冷的解剖刀切割凝膠小塊進行冷凍斷裂。
c. 解凍，置碎塊于30%甘油—1%戊二醛磷酸緩沖液中解凍。
d. 置換甘油，放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS沖洗，3min×2。
e. 免疫標記。
f. 1%鋨酸，室溫固定30min。
g. 系列梯度乙醇脫水，臨界點干燥，噴鍍鉑—碳膜，次氯酸鈉清洗復型，蒸餾水洗，撈于有Formvar膜銅網上透射電鏡觀察。
2) 超薄切片法
步驟：a至e同臨界點干燥法。
f. 1%鋨酸，室溫固定2h，系列酒精或丙酮脫水，常規電鏡包埋。
g. 切半薄片，光鏡定位合適的斷裂部位，再切超薄切片，鈾鉛染色，透射電鏡觀察。
斷裂標記法目前文獻報告應用較多的是植物凝集素—膠體金免疫標記技術，常用的如刀豆球蛋白(Con A)-- 膠體金免疫標記技術，Con A能與細胞膜中的甘露糖結合，能標記內質網膜、核被膜以及細胞膜的EF面，有助于糖蛋白在超微結構水平的定位。
為保證實驗結果的準確性，每組實驗在免疫標記階段應設立對照組。
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