實驗概要
以培養誘導的無菌 S. carpocapsae A24品系感染期線蟲為材料，提取高質量RNA，為后續cDNA的構建做準備。
主要試劑
1. 主要試劑
1) Trizol Reagent，美國Invitrogen公司；
2) DEPC，Bio Basic inc公司；
3) 氯仿、異丙醇，美國進口；
4) 溴化乙錠（ethidium bromide，EB），華美生物工程公司；
5) 其他試劑為國產分析純。
2. 主要溶液
1) 溴化乙錠（EB）溶液（10 mg/mL）：稱取EB約300 mg于試劑瓶中，加入雙蒸水30 mL，充分混勻，4℃備用。
2) 50×TAE電泳緩沖液
Tris 242 g
EDTA (0.5 mol/L，pH 8.0) 100 mL
冰乙酸 57.1 mL
加水定容至1000 mL
主要設備
1. MDF-192型超低溫冰箱，日本三洋電機株式會社；
2. UV-2102 Pc型紫外分光光度計，UNICO（上海）儀器有限公司；
3. CF43S超凈工作臺，Gelman公司；
4. 高速冷凍臺式離心機，Heraeus Sepatech公司；
5. Capsule HF-120型微量離心裝置，Millipore公司；
6. BL150S型電子天平，德國Sartorius公司；
7. GB 1302型天平，Mettler-Toledo儀器（上海）有限公司
8. XQ.WY21-600IIR臥式高壓蒸汽消毒器，廣州市醫療設備廠；
9. DYCD-31D型水平電泳槽，北京六一儀器廠；
10. EPS1001型電泳電源，Amersham Pharmacia公司；
11. 連續可調微量移液器，德國Eppendorf公司；
12. AlphaImager 2200型凝膠圖像分析系統，Alpha Innotech公司；
實驗材料
小卷蛾斯氏線蟲 S. carpocapsae A24品系
實驗步驟
1. 無RNA酶實驗用品的處理
1) 8%洗液：80 g重鉻酸鉀溶于1000 mL水中，不停攪拌的同時緩緩加入100 mL濃硫酸。配制過程中注意不可使溫度上升太快或不要出現鉻酸結晶。
2) 0.2％DEPC水：100 mL 滅菌雙蒸水中（125℃，滅菌1 h）加入0.2 mL DEPC ，用力振蕩混勻，室溫過夜，放于搖床上振蕩，100 rpm；滅活剩余的DEPC（125℃，1 h），室溫貯存。
說明：所有含氨基的化學物質（如：Tris，MOPS，EDTA，HEPES等）都不能用DEPC直接處理，而用DEPC處理過的水配制。
3) 玻璃器皿：燒杯、量筒、玻璃棒、試劑瓶、容量瓶等經洗液浸泡過夜，沖洗晾干，泡0.2% DEPC處理過的雙蒸去離子水，約12 h，滅菌樂百氏沖洗，200℃，10 h 烘干，125℃高溫滅菌1h。
4) 研缽，研棒及剪刀、鑷子等工具200℃，10 h 烘干，125℃高溫滅菌1h。
5) 塑料制品：槍頭、離心盒、槍頭盒等塑料制品應為一次性用品，在0.2% DEPC處理過的雙蒸去離子水中浸泡過夜，125℃高溫滅菌1h。
6) 比色杯：濃硫酸：甲醇（1：1）浸泡1小時，0.2% DEPC處理過的雙蒸去離子水徹底沖洗。
7) 瓊脂糖凝膠電泳槽的處理：去污劑洗凈，水沖洗，乙醇干燥，裝滿3％的H2O2溶液于室溫放置30 min以上，0.2％DEPC處理過的雙蒸去離子水徹底沖洗電泳槽。
2. 感染期線蟲總RNA的提取
采用 Trizol 溶液提取 A24 線蟲的總RNA，按1 mL Trizol溶液處理100 mg組織樣品的量。
1) 吸取0.4 mL的 Trizol溶液到-80℃貯存的線蟲沉淀中，混勻，立即吸到已加液氮的研缽并研磨，再加0.4 mL的Trizol溶液到離心管中沖洗線蟲殘留液，并加到研缽繼續研磨至粉末狀，連同液氮倒入干凈燒杯；
2) 使線蟲粉末在室溫靜置30～45 min液化，再加入200 μL Trizol溶液，混勻，按每管1.1 mL分裝到1.5 mL離心管(無RNA酶, 下同) 中；
3) 4℃，12000 g，離心10 min；
4) 取上清轉入(約1mL) 已編號新的1.5 mL離心管中；
5) 室溫靜置5 min；
6) 每管加入0.2 mL的氯仿(0.2體積Trizol )，蓋緊蓋，劇烈振蕩15 秒；
7) 室溫靜置3 min；
8) 4℃, 12000 g, 離心10 min；
9) 小心吸取上層水相，轉入另一已編號新的1.5 mL離心管，測量其體積；
10) 加入1倍體積的氯仿，蓋緊蓋,劇烈振蕩15秒；
11) 室溫靜置3 min；
12) 4℃，12000 g，離心10 min；
13) 小心吸取上層水相，轉入另一已編號新的1.5 mL離心管；
14) 加入0.5 mL的異丙醇(0.5體積Trizol )，輕輕顛倒混勻；
15) 室溫，靜置10min；
16) 4℃，12000 g，離心10 min；
17) 小心吸去上清，加入1 mL75％的乙醇(預冷)，并輕柔顛倒，洗滌沉淀；
18) 4℃，7500 g，離心5 min；
19) 小心棄上清，微離，吸去剩余乙醇，室溫干躁10 min；
20) 各管用50 μL DEPC處理過的雙蒸去離子水溶解，分裝，-80℃貯存（可貯存5周）；
21) 以紫外分光光度法和1％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度和質量。
3. 總RNA 濃度的測定（紫外分光光度計法）
取待測RNA樣品10 μL至一潔凈離心管中，加蒸餾水稀釋到2 mL，轉入到DEPC處理過的石英比色杯中，小心排掉氣泡，以等體積蒸餾水進行空白測定，分別測定260 nm、280 nm及320 nm（參比波長）時樣品的光吸收值。儀器自動給出RNA的純度，根據公式計算RNA的含量：
RNA含量（μg/μL）=OD600×稀釋倍數×40/1000
純RNA樣品的OD260/OD280比值為1.7~2.0，若低于該值，表明存在蛋白質污染，可重新用酚/氯仿抽提[94]。
4. 瓊脂糖凝膠電泳
1) 將洗凈、干燥的電泳模具，水平放置在工作臺上；
2) 按需要配制的凝膠濃度，在1×TAE電泳緩沖液中加入瓊脂糖，搖勻，在微波爐內將瓊脂糖溶液以最短時間完全溶解，待冷卻至60℃時，加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5 μg/mL，充分混勻；
3) 插入適當的梳子，將溫熱的凝膠倒入模具中，凝膠厚度為3 mm～5 mm，置于室溫下凝固；
4) 待凝膠凝固后，小心移去梳子，將帶模具的凝膠置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，使液面高出凝膠1mm～2 mm；
5) 用微量移液器將樣品與上樣緩沖液混合并將混合液小心加入上樣孔內，同時加入合適分子量范圍的DNA分子量標準作為對照；
6) 蓋上電泳槽蓋，調節電壓100 V，電泳45min左右；
7) 電泳完畢后將凝膠置于紫外透射檢測儀上觀察結果，用凝膠成像系統照相。