阻斷NFκB信號通路提高兒童急性淋巴細胞白血病化療效果

　　兒童急性淋巴細胞白血病（ALL）是兒童最常見惡性腫瘤之一，現階段我國兒童ALL的治愈率約為70%（國際最高治愈率約為80%）。患者對相關治療藥物的耐藥以及由此引起的復發是治愈率難以提升的瓶頸。因此，如何破解兒童白血病耐藥復發及其克隆演化機制已成為這一領域的研究焦點。

　　上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心、國家兒童醫學中心的研究人員發表了題為“Blocking ATM-dependent NF-κB pathway overcomes niche protection and improves chemotherapy response in acute lymphoblastic leukemia”的文章，率先證實阻斷ALL細胞中ATM依賴的NF-κB信號通路能夠克服來自骨髓微環境對化療后微小殘留白血病細胞的保護作用，顯著提高ALL的化療效果，對臨床后期開展ALL聯合治療具有重要意義。

　　這一研究成果公布在血液學國際權威學術雜志Leukemia（《白血病》，影響因子10.023）上，文章通訊作者分別為上海兒童醫學中心兒科轉化醫學研究所所長周斌兵教授，上海兒童醫學中心兒科轉化醫學研究所段才聞副研究員和上海市轉化醫學協同創新中心主任陳紅專教授。

　　背景

　　ALL是兒童最常見惡性腫瘤之一，也是所有兒童疾病中造成死亡的主要原因。通過風險分層組合化療和改善支持治療，ALL患者的5年生存率已達到80％以上。然而，近20％的患者仍然會復發，導致治療失敗。因此必須進行ALL復發綜合機制研究，制定克服耐藥性和ALL復發的治療策略。

　　一系列研究表明遺傳突變會導致兒童ALL的復發。科學家們通過基因譜分析和測序確定了幾種復發特異性耐藥突變，同時也提出殘留耐藥細胞可以在化療中存活，然后隨后利用獲得性抗藥性來推動克隆進化，導致白血病快速增殖。然而，剩余的ALL細胞在化療中所處的位置及其存活機制，尚不清楚。 越來越明顯的是，白血病細胞與其微環境（或生態位）之間的相互作用在疾病復發過程中起著重要作用。

　　骨髓（BM）微環境是一個復雜且良好調節的微環境，由非造血基質細胞，細胞外基質和細胞因子組成。它調節造血干細胞（HSCs）的穩態，并參與ALL的發病機制和耐藥性。

　　重要發現

　　上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心的研究人員此前曾發現通過化療后ALL細胞分泌的細胞因子會召集BM細胞，重建了一個不斷發育的環境，來保護殘留ALL細胞。這種細胞因子，即GDF15，CCL3和CCL4，在ALL進展中起重要作用。然而，這些細胞因子如何通過化療誘導，仍然未知。

　　在最新這項研究中，研究組發現化療引起ALL細胞基因損傷應答（DDR）和NF-κB信號通路激活，其中DDR關鍵蛋白ATM結合并激活泛素化連接酶TRAF6，導致NF-κB組份IκB降解，進而使NF-κB核心組份P65蛋白釋放入核，促進其直接下游細胞因子GDF15，CCL3和CCL4的表達和分泌增加，在骨髓中形成保護殘留白血病細胞的微環境，促進導致復發微小殘留白血病細胞的生存，為ALL耐藥復發突變的獲得奠定了基礎。

　　與此同時，研究人員還利用ATM和P65特異性小分子抑制劑體內阻斷ATM依賴的NF-κB信號通路，聯合臨床一線化療藥物，顯著減少微小殘留白血病細胞并提高ALL的化療效果。

　　這一研究成果闡明了ALL復發前期起始克隆產生的機制，揭示了克服ALL耐藥復發潛在的治療靶點，為進一步提高我國兒童ALL治愈率奠定堅實的理論基礎。

　　國際血液病權威專家、哥倫比亞大學癌癥遺傳研究所Adolfo Ferrando教授高度肯定此項研究成果，他認為，ALL的耐藥復發是世界性難題，阻斷ATM依賴的NF-κB信號通路提高ALL化療效果具有非常重要的臨床轉化和治療意義。

　　化療引起ALL細胞系和原代細胞中的細胞因子上調

　　研究人員以前曾發現ALL保護微環境由細胞因子（GDF15，CCL3和CCL4）重建，這些細胞因子經Cytrarabine（Ara-C）處理后會上調。

　　為了確定化療誘導這些細胞因子的機制，他們用化療藥物Ara-C，柔紅霉素（DNR），巰嘌呤（6-MP），甲氨蝶呤（MTX），長春新堿（VCR），CTX和地塞米松（DEX）治療了兩種ALL細胞系（Nalm6和Reh），然后通過qRT-PCR測定細胞因子的表達水平。

　　如上圖所示，Nalm6和Reh細胞中GDF15，CCL3和CCL4的mRNA水平以藥物劑量依賴性方式顯著增加。在實驗的不同化學治療劑中，Ara-C，DNR和6-MP引起了直接DNA損傷和最顯著的細胞因子上調，因此用于進一步研究。

　　為了補充mRNA水平檢測，在用Ara-C，DNR和6-MP處理后，研究人員通過ELISA在Nalm6和Reh細胞中測定了三種細胞因子的分泌蛋白水平。結果顯示，Nalm6和Reh細胞中三種細胞因子的蛋白質水平以劑量依賴性方式顯著增加（圖S1C和D）。因此研究人員認為化療藥物，特別是DNA損傷劑，可以在不存在BM微環境的情況下直接誘導ALL細胞中的趨化因子產生。在化療處理的ALL細胞系和原代細胞中，微環境保護相關細胞因子的表達水平增加。

　　化療后NF-κB通路被激活

　　轉錄因子NF-κB在應激條件下能調節細胞因子，如CXCL10和IL6的產生，因此在腫瘤侵襲和炎癥反應中起關鍵作用。

　　在最新這項研究中，研究人員發現NF-βB途徑可能調節參與微環境保護細胞因子的表達。他們發現了經過Ara-C處理后，IκB蛋白水平會降低（圖3a），NF-κB組分之一——p65，在Nalm6和Reh細胞中易位到細胞核中（圖3b；圖S5A）。

　　這一結果表明NF-κB途徑經Ara-C處理后激活。為了研究NF-κB途徑與細胞因子上調之間的因果關系，研究人員使用CRISPR/Cas9方法（Nalm6-sgP65和Reh-sgP65）構建p65敲低細胞系（圖S5B和C），發現p65中的細胞因子在Ara-C，DNR或6-MP處理后，細胞顯著減少（圖3c；圖S5D）。類似地，NF-κB抑制劑PDTC阻斷p65易位進入細胞核（圖S5A）并在Nalm6細胞中Ara-C處理后抑制細胞因子表達（圖S5E），從而支持NF-κB途徑被激活并參與體外調節GDF15，CCL3和CCL4的表達。

　　阻斷NF-κB途徑增強了ALL細胞對化學療法的敏感性

　　研究人員還分析Nalm6和Reh ALL小鼠模型中阻斷ATM依賴性NF-κB途徑的化學敏感性。用Ara-C處理2天后，殺死小鼠并通過離體熒光共聚焦成像和FAC從顱骨和BM中檢測到GFP+ ALL細胞（圖6a）。

　　如圖6b所示，Nalm6-GFP，Nalm6-sgP65-GFP和Nalm6-shATM-GFP細胞在化學療法之前將整個血管浸入顱骨中。化療后Nalm6-sgP65-GFP和Nalm6-shATM-GFP小鼠頭骨中殘余GFP + ALL細胞的數量顯著低于Nalm6-GFP小鼠（圖6c，d）。同時，超過10％的GFP+ ALL細胞保留在Nalm6-GFP小鼠的BM中，而少于5％的GFP+ ALL細胞保留在Nalm6-sgP65-GFP和Nalm6-shATM-GFP小鼠（圖6e，f）。

　　這些結果表明，在體內阻斷ATM依賴性NF-κB活化后，Nalm6細胞對Ara-C的敏感性提高。在Reh ALL異種移植模型中獲得了類似的數據（圖S10A-E）。

　　由于GDF15阻斷抗體可以抑制ALL微環境，因此研究人員認為添加外源GDF15可以逆轉阻斷ATM依賴性NF-κB通路的體內效應。為了驗證這一假設，他們確定了p65和ATM敲低ALL模型對化療的敏感性是否可以通過外源性添加GDF15來逆轉。結果顯示殘留的白血病細胞明顯增加了GDF15預處理后，Ara-C處理的Nalm6-shATM和Nalm6-sgP65（圖6g，h）。（此處采用了賽業的基因敲入小鼠）

　　這一研究成果闡明了ALL復發前期起始克隆產生的機制，揭示了克服ALL耐藥復發潛在的治療靶點，為進一步提高我國兒童ALL治愈率奠定堅實的理論基礎。

　　國際血液病權威專家、哥倫比亞大學癌癥遺傳研究所Adolfo Ferrando教授高度肯定此項研究成果，他認為，ALL的耐藥復發是世界性難題，阻斷ATM依賴的NF-κB信號通路提高ALL化療效果具有非常重要的臨床轉化和治療意義。