花粉管鈣通道抑制后蛋白質組學研究

實驗概要

本實驗運用蛋白質組學技術手段對鈣通道受抑制后花粉管中蛋白質表達模式進行研究，以期鑒定出與Ca² 調節花粉管生長相關的蛋白質，拓展對Ca² 在花粉管生長調節機制的認識。

主要設備

IPGphor II等電聚焦系統(Amersham Biosciences，Sweden)

ZipTipC18 (Millipore，MA，USA)

電噴霧離子化串聯質譜 (ESI-MS/MS，Micromass，UK)

紫外分光光度計

實驗材料

白皮松花粉

實驗步驟

1. 材料培養

白皮松花粉，置于以下三種培養基，25℃條件下搖床(120rpm)暗培養72h。培養基中所含DMSO濃度低于1%，該濃度對于花粉萌發和花粉管生長無影響。

1) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ (CKM)

2) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 100μM Nif

3) 15%蔗糖 0.01%H₃BO₃ 0.01%CaCl₂ 250μM Nif

2. 花粉總蛋白的提取

培養的白皮松花粉，過濾后液氮研磨，再將其粉末溶解到10%TCA溶液中(丙酮配制，含0.07%巰基乙醇)，于-20℃下放置兩小時。15000rpm離心10min，棄除上清液，再在三倍體積的丙酮中沉淀溶解(含0.07%巰基乙醇)，-20℃過夜。離心，棄除上清液，沉淀復溶到80%丙酮中(含0.07%巰基乙醇)，-20℃放置40min。離心棄除上清液，將沉淀風干后，用蛋白裂解液溶解(7M  urea，2M thiorea，4% (w/v)CHAPS，2%(V/V)ampholine pH 3.5-10，1%  DTT)，之后離心取上清，通過上述過程提取出來的蛋白質，在紫外分光光度計用Bradford法測定濃度(DU 640  Spectrophotometer，Beckman，USA)。

3. 雙向電泳和圖像分析

雙向電泳實驗主要依據《安瑪西亞雙向電泳手冊》中的建議方法，并略加改進。等電聚焦之前將干膠條 (pH  3-10L，600px)溶解在450μl再水化液中(含8M urea，2% (w/v) CHAPS，0.5% (v/v) ampholine pH  3-10，0.002%bromophenol blue)，室溫過夜。再水化溶液中含600μg蛋白質樣品。等電聚焦實驗使用IPGphor  II等電聚焦系統(Amersham Biosciences，Sweden)。等電聚焦使用下列參數：500V 1h，1000V  1h，然后將電壓增加到8KV，升壓模式選取“step by  step”，最后總電壓伏時為64kVh。第二向電泳之前膠條先平衡兩次，每次分別15min，第一次平衡液為：50 mM Tris-HCl (pH  8.8)，6M urea， 30%glycerol，2%SDS，0.002% bromophenol blue，1%DTT；第二次平衡液：50  mM Tris-HCl (pH 8.8)，6M urea， 30%glycerol，2%SDS，0.002% bromophenol  blue，2.5% idoacetamide。平衡后膠條放置在12.5%單一梯度聚丙烯酰胺凝膠上，用0.5%的瓊脂糖封膠，每塊膠40  mA，電極液保持在20℃跑數小時直到指示劑到達膠底部。凝膠用0.1%考馬斯亮蘭染色。

電泳后的凝膠用300 dpi掃描，圖像用ImageMaster 2D Platinum 5.0分析(Amersham  Biosciences, Sweden)，表觀分子量根據標準蛋白分子量來決定。同一處理的二維電泳重復3次，選取差異表達的蛋白質進行質譜分析。

4. 膠內酶切

將蛋白質斑點從膠上切下后，用50%乙腈和25mM NH₄HCO₃脫色，50 mM NH₄HCO₃處理在40℃下處理1h，水洗一次，10  mM DTT，60℃還原1h，還原后真空濃縮抽干，再用40 mM碘乙酰胺處理30min后水洗抽干，最后用10μl 20ng/μl  trypsin (modified sequencing grade，Sigma)  37℃酶切12-16h。肽段用0.1%三氟乙酸和50%乙腈提取，真空濃縮置于-40℃。

5. 蛋白質質譜鑒定

酶切后的蛋白質樣品，用ZipTipC18 (Millipore，MA，USA)  脫鹽后，用電噴霧離子化串聯質譜測序列(ESI-MS/MS，Micromass，UK)。數據庫檢索使用MASCOT搜索引擎(www.matrixscience.com)，選擇MSDB或NCBI數據庫;  對于檢索結果網站提供一個可信度分值(MOWSE Score)，如果實際值大或等于該值則錯誤率小于5%。當出現多個大于標準MOWSE  Score值的時候，一般選取得分最大的結果，同時還參考其匹配的肽段序列覆蓋率(sequence  coverage)以及雙向電泳膠上表觀分子量和等電點。