腺病毒載體的優點：
1. 宿主范圍廣, 對人致病性低
腺病毒載體系統可廣泛用于人類及非人類蛋白的表達。腺病毒可感染一系列哺乳動物細胞，因此在大多哺乳動物細胞和組織中均可用來表達重組蛋白。特別需要指出的是：腺病毒具有嗜上皮細胞性，而人類的大多數的腫瘤就是上皮細胞來源的。另外，腺病毒的復制基因和致病基因均已相當清楚，在人群中早已流行（70-80%成人體內都有腺病毒的中和抗體存在）。人類感染野生型腺病毒后僅產生輕微的自限性癥狀，且病毒唑治療有效。
2. 在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因
逆轉錄病毒只能感染增殖性細胞，因此DNA轉染不能在非增殖細胞中進行，而必須使細胞處于持續培養狀態。腺病毒則能感染幾乎所有的細胞類型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細胞。腺病毒是研究原代非增殖細胞基因表達的最佳系統，它可以使轉化細胞和原代細胞中得到的結果直接進行對比。
3. 能有效進行增殖，滴度高
腺病毒系統可產生1010到1011VP/ml，濃縮后可達1013VP/ml，這一特點使它非常適用于基因治療。
4. 與人類基因同源
腺病毒載體系統一般應用人類病毒作為載體，以人類細胞作為宿主，因此為人類蛋白進行準確的翻譯后加工和適當的折疊提供了一個理想的環境。大多數人類蛋白都可達到高水平表達并且具有完全的功能。
5. 不整合到染色體中，無插入致突變性
逆轉錄病毒可隨機整合到宿主染色體，導致基因失活或激活癌基因。而腺病毒則除了卵細胞以外幾乎在所有已知細胞中都不整合到染色體中，因此不會干擾其它的宿主基因。在卵細胞中整合單拷貝病毒則是產生具有特定特征的轉基因動物的一個較好的系統。
6. 能在懸浮培養液中擴增
293細胞可以適應懸浮培養，這一調整可使病毒大量擴增。大量事實證明懸浮293細胞可在1～20L的生物反應器中表達重組蛋白。
7. 能同時表達多個基因
這是第一個可以在同一細胞株或組織中用來設計表達多個基因的表達系統。最簡單的方法是將含有兩個基因的雙表達盒插入腺病毒轉移載體中，或者用不同的重組病毒共轉染目的細胞株來分別表達一個蛋白。測定不同重組病毒的MOI比值可正確估計各重組蛋白的相對共表達情況。
正是由于具有以上一些優點，腺病毒被極其廣泛地應用于體外基因轉導、體內接種疫苗、和基因治療等各個領域。
結 構
腺病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長約36kb，衣殼（capsid）呈規則的20面體結構，直徑約80-110nm。衣殼含有240個六聯體（hexon）、12個五聯體（penton）及12根纖毛（fiber），除此之外還有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX、IIIa和IVa2等。六聯體是形成病毒衣殼20個三角形面的主要蛋白，12個頂端是5個五聯體亞單位和3個纖毛蛋白構成的復合物，12根纖毛以五聯體蛋白為基底由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節區（knob）。五聯體和纖毛的頭節區可與細胞表面的病毒受體結合，在病毒感染細胞過程中起著非常重要的作用。腺病毒的基因組以線性的雙鏈DNA形式存在，由蛋白VII和一種稱為mu的小蛋白緊密地環繞在其周圍，起到類組蛋白樣的作用。另一種蛋白V將這種DNA-蛋白復合物連接起來，并通過蛋白VI與病毒衣殼連接在一起。在兩條鏈的5′端各以共價鍵結合著一個被稱為DNA末端蛋白（pTP）復合物（DNA-TPC）的特化的結構，與腺病毒復制密切相關。腺病毒基因組的兩端各有一段100bp的反向末端重復序列（ITR），是復制的起始位點。在左端ITR的3′側有一段長約300bp的包裝信號（ψ）介導腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。對腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號（ψ）的約0.5kb的序列是順式作用元件，也就是說必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過輔助病毒（或細胞）反式補足。
分類及致病性：
自上個世紀50年代發現并成功分離腺病毒以來，已陸續發現了100余個血清型，其中人腺病毒有47種，分為A、B、C、D、E和F六個亞群（subgroup）。基因治療常用的人的2型及5型腺病毒在血清學分類上均屬C亞群，在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常強，滴度通常可以達到109pfu (plaque forming unit)/ml，其在單個細胞中的基因組拷貝數可達104（約占細胞總DNA的10%）。病毒顆粒比較穩定，通過CsCl梯度離心可以達到1010~1011pfu/ml，滿足動物實驗的要求。
2型和5型腺病毒的致病性主要表現為可以導致兒童上呼吸道感染。在感染的最初幾天，由于病毒大量復制和釋放，會出現中度發熱、渾身酸痛、乏力、咽痛等癥狀。但這些癥狀通常是比較短暫而輕微的，在以后的幾天里，會隨著中和抗體的產生而逐漸消失。雖然可以說高滴度和高免疫原性是腺病毒的主要特點，但也是相對的，如8型腺病毒（主要感染小腸和結膜組織）可以在扁桃體等淋巴組織中潛伏下來。在C亞群的其他一些腺病毒中也可以見到同樣的現象，這是因為病毒的E3區編碼的功能可使其逃避宿主的免疫打擊。這似乎有助于理解為何腺病毒載體在造血系細胞中的基因轉導效率明顯低于其他組織、細胞。
腺病毒的生活周期
腺病毒的生活周期可以分為兩個截然不同卻又不能割裂開來的兩個階段。第一階段包括腺病毒顆粒粘附和進入宿主細胞，將基因組釋放到宿主細胞核中，以及有選擇性地轉錄和翻譯早期基因。在這個階段，細胞為病毒基因組復制和腺病毒晚期基因表達并最終釋放成熟的感染顆粒，即第二階段，作好了準備。第一階段將在6~8個小時內完成，第二階段則更快，只需4~6個小時。
粘附和進入細胞
腺病毒感染細胞的過程是從腺病毒纖毛的頭節區粘附到細胞表面的特異性受體開始的。因為人腺病毒主要與柯薩奇B病毒共用一種受體，因此這種受體被稱為柯薩奇/腺病毒受體即CAR（coxsackie/adenovirus receptor）。接下來病毒纖毛基底部五鄰體表面的三肽RGD與細胞表面的αvβ3和αvβ5整合素結合，通過內吞作用將腺病毒內化到細胞中并進入溶酶體。在溶酶體的酸性環境下，腺病毒衣殼的構象將發生變化，被從溶酶體中釋放出來，躲過溶媒體的消化作用。最后，腺病毒顆粒轉位到細胞核，通過核孔將病毒DNA釋放到細胞核內。相對于脂質體轉染，腺病毒基因組進入細胞核是一個非常高效的過程，一般可以達到40%，前者雖然進入胞質的效率與后者相當，而DNA進入細胞核的效率卻只有前者的1/1000。
轉錄與復制：
一旦病毒基因組進入細胞核，就將進行一系列的復雜而有序的逐級放大的剪切和轉錄過程。一般的，以病毒DNA開始復制為分界線，按轉錄時間的先后，將腺病毒基因大致區分為早期（E1~4）和晚期轉錄單位（L1~5）。各種腺病毒基因又可以進一步地分為更小的轉錄單位，如E1區可以進一步分為E1A和E1B，每個轉錄單位都至少有一個獨特的啟動子。腺病毒基因組進入細胞核后，細胞轉錄因子首先與E1A區上游的增強子結合，表達E1A蛋白，該蛋白的作用是調節細胞代謝，使病毒DNA更易于在細胞中復制。E1A蛋白還可以激活其他早期基因（E1B、E2A、E2B、E3和E4）的啟動子，其中E2B驅動另外三個與病毒復制有關的早期基因轉錄單位末端蛋白前體（pTP, precursor terminal protein）、單鏈DNA結合蛋白（ssDBP, single-stranded DNA binding proteins）以及DNA聚合酶（DNA pol, DNA polymerase）的表達，這三個基因的表達產物緊密地結合成一個復合物，與至少三種細胞蛋白相互作用，啟動病毒基因組的復制。
一般而言，DNA的復制是由RNA啟動的，而在腺病毒卻是所謂的蛋白啟動（protein-priming）。如前所述，腺病毒雙鏈DNA的每條單鏈的5′端有pTP蛋白結合，pTP通過其Ser-OH與DNA 5′端的dCMP 5′磷酸之間形成磷酸二脂鍵。腺病毒的DNA復制首先是以5′端結合有pTP的dCMP作為引物，以3′端的末端反向重復序列（ITR）為模板，進行鏈置換（strand displacement）合成，置換出的單鏈分子可以自我退火環化，形成鍋柄樣環形分子，然后這種環形分子再以相同的機制合成出子代雙鏈DNA分子。
病毒基因組復制通常在感染后數小時開始，同時早期基因的轉錄和翻譯被關閉，晚期基因開始表達。大部分的晚期基因的轉錄是以一個共同的主要晚期啟動子（MLP, Major Late Promoter）調控的。實際上，MLP的活性與病毒基因組復制密切相關，有研究表明一旦腺病毒基因組開始復制MLP的活性將明顯增強，對此我們將另外行文詳述。晚期基因主要編碼腺病毒的結構蛋白。病毒結構蛋白在細胞核內聚集形成病毒衣殼，病毒的基因組被包裝進去，形成有感染能力的病毒顆粒，并最終裂解宿主細胞被釋放出去，完成腺病毒的生活周期。腺病毒有明顯的種屬特異性，人的野生型5型腺病毒（wtAd5）感染其他的非人類細胞（如鼠類細胞）后可以表達早期基因，基因組也可有一定程度的復制并能夠形成一些不成熟的病毒顆粒，卻不能形成成熟的病毒顆粒，也不能二次感染其他細胞。
腺病毒基因產物的主要功能
E1區基因表達產物
可以進一步分為E1A和E1B。E1A主要由兩種成分構成，分別為289R（或13S）和243R（或12S）。這些E1A蛋白的主要功能是調節細胞代謝，使細胞對病毒復制更易感
E1B19K與細胞Bcl-2基因的表達產物同源，可以通過滅活和清除Bax家族成員來防止細胞發生凋亡或壞死。E1B55K基因產物可以下調p53基因的轉錄水平，當然這種調節功能不是絕對的，其他一些腺病毒基因（如E4 orf6）也參與了這一過程。另外，E1B55K基因產物還與病毒復制、病毒晚期mRNA的轉錄以及病毒RNA的轉運有關。
E2區基因表達產物
可分為E2A和E2B。其中，E2A即DNA結合蛋白（DBP，DNA Binding Protein）；E2B主要產物有兩種，分別是末端蛋白前體（pTP）和病毒DNA聚合酶（pol）。三種蛋白與至少三種細胞內的因子相互作用，啟動腺病毒DNA復制以及病毒晚期基因的轉錄和翻譯過程。
E3區基因表達產物
主要功能是破壞宿主的免疫防御機制，而與病毒基因組的復制無關。E3基因的產物之一11.6Kd，由于可以在病毒感染的晚期裂解細胞并釋放病毒顆粒而被稱為腺病毒死亡蛋白（ADP，adenovirus death protein）。gp 19K蛋白可以在內質網上與MHC I類分子的重鏈結合阻止其轉運到細胞表面，并且可以延緩MHC I的表達。RID α&β以及14.7Kd可以抑制由TNF誘發的細胞凋亡，促進Fas降解，下調TNF受體水平。
E4區基因表達產物
E4區的基因產物通常被稱為orf 1~6/7，主要與病毒信使RNA的代謝有關。還有促進病毒DNA復制以及關閉宿主蛋白合成的功能。研究發現，一些E4產物可以與DNA激活的蛋白激酶結合，防止病毒DNA發生串聯。由于該激酶可以激活p53基因，因此可以認為一些E4區基因產物可以抑制細胞凋亡。許多E1B和E4基因產物都與拮抗E1A蛋白功能有關。比如，E4 orf4抑制E1A對E2F啟動子的激活；E4 orf3
VA RNA
使一些由腺病毒轉錄的非翻譯RNA，與腺病毒抵抗宿主細胞免疫有關。
二. 重組腺病毒載體
（一） 構建重組腺病毒載體的目的
1. 增加外源基因的裝載容量 我們知道，腺病毒有一定的包裝容積限制，大約在75~105%，即28~40kb左右，若超出此范圍則或是不能包裝或是發生分子重排。以5型腺病毒基因組36kb計算，在不對腺病毒基因組作任何改變的情況下，腺病毒載體最多可以轉運2.8kb左右的外源基因，這對于許多基因治療方案來說是遠遠不夠的。為了進一步地擴大腺病毒載體的應用范疇，有必要缺失其基因組中的某些反式作用元件以增大其裝載容積。
2. 降低免疫原性 如前所述，強免疫原性是腺病毒的主要特點之一，在有免疫功能的動物體內會很快被清除掉，導致其所攜帶的目的基因表達時相比較短。研究表明，腺病毒的強免疫原性主要是由其衣殼蛋白和晚期基因表達產物（L1~L5）引起的。因此，可以通過控制腺病毒晚期基因的表達來降低其免疫原性。
3. 提高靶向性 腺病毒的宿主范圍廣的特點使其被廣泛應用于基因治療的各個領域，然而在許多基因治療方案中只需感染特定的組織或細胞，矯枉過正，反受其害。有多種方案用于提高腺病毒載體的靶向性，主要可以概括為以下兩個研究方向：其一是對腺病毒的纖毛蛋白和五聚體進行改造，使其可以特異性地與某些組織、細胞表面的受體結合；另一個研究方向是調控腺病毒生長所必需的基因，使其可以靶向特定的組織或細胞內復制增殖，表達目的基因。
（二） 腺病毒載體的分類：
按生活周期不同，大體上可將重組腺病毒載體可分為復制缺陷型（replication- defective）和增殖型（replication-competent）腺病毒載體兩大類別。