酵母培養與酒精發酵

實驗概要

掌握酵母培養與酒精發酵的基本原理和操作方法，了解影響酵母培養與酒精 補料分批發酵的主要因素。

實驗原理

麥芽中可供發酵的物質主要是淀粉，而釀酒酵母由于缺乏相應的酶，所以不能直接利用淀粉進行酒精發酵，因此必須對原料進行預處理，通常包括蒸煮（液 化） 、糖化等處理。蒸煮可使淀粉糊化，并破壞細胞，形成均一的醪液，目前多 數廠家開始利用α-淀粉酶的液化作用來替代蒸煮過程，這樣可大大減少能源消 耗。液化后的醪液能更好地接受糖化酶的作用，并轉化為可發酵性糖，以便酵母 進行酒精發酵。

α-淀粉酶，又稱為 1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶，廣泛存 在于動、植物和微生物體中，如麥芽或動物的唾液、脾臟中均含有較多的α-淀 粉酶，而當今α-淀粉酶的工業化生產也主要是利用微生物工程菌進行生產的。 α-淀粉酶容易溶解于水和較稀的緩沖液中，它能夠切斷淀粉分子中的α-1，4 糖 苷鍵，生成糊精及少量麥芽糖或葡萄糖，從而使淀粉遇碘變藍的特異性顏色反應 逐漸消失，由此顏色反應消失的速度即可測出該酶的活性。 

工藝流程如下：麥芽→加水拌料→液化→糖化→發酵→蒸餾→酒精
                                                                 ↑
                                                             一級種子
                                                                 ↑
                              耐高溫酒精活性干酵母→活化

發酵酒精含量的測定方法很多，如常規蒸餾法、碘量滴定法、比色法及 改良康維法等，本實驗采用第一種方法。

主要試劑

12^oBx 麥芽汁培養基、麥芽汁（詳見實驗步驟）

主要設備

生化培養箱，搖床，離心機，分光光度計，糖份、酒精測定試劑及裝置。（詳見實驗步驟）

實驗材料

1、酵母菌種，使用前必須活化。（詳見實驗步驟）

實驗步驟

1、培養基準備
麥芽汁培養基：將干麥芽粉，以 200g 麥芽加 700ml 去離子水，加入 1g 中溫 α-淀粉酶，在 65℃水浴鍋中處理 3-4h，糖化程度可用碘滴定。將糖化液用 4-6 層紗布過濾，濾液如混濁不清，可用雞蛋白澄清，方法是將一個雞蛋白加水約 20mL，調勻至生泡沫時為止，然后倒入糖化液中攪拌煮沸后再過濾。將濾液調 節至 pH 約 6.4。每組分裝后于 121℃，15min，滅菌備用。

2、酵母活化
3%酵母粉（7.5g） ，2%葡萄糖（5g） ，溶解于 250ml 去離子水中。在 35℃復 水 20min，降溫至 32℃培養 2h。

3、一級種子培養
250mL 三角瓶， oBx 麥芽汁培養基， 12 裝液量 50mL； 接活化液約 4mL， 30℃， 150rpm/min 搖瓶培養 6-8h。細胞濃度達 1.5×108 個/mL 以上，無雜菌，無死細 胞。 采用血球計數法進行細菌形態觀察和活菌計數，并記錄實驗結果。在無菌操 作臺取培養液 0.5ml，加入 2 滴 0.05%美藍染色液，置于裝有 4.5ml 無菌生理鹽 水的試管中搖勻。無菌操作用移液管滴取菌液于血球計數板中央，放置 3 分鐘后 用顯微鏡觀察計數，并且計算出芽率。詳見《微生物學實驗 P54》 。

4、乙醇發酵

①接種：按 8%接種量將一級種子分別接入至 2 只裝有 100ml 麥芽汁培養基 的三角瓶中靜止培養。其中，一瓶用于測定發酵參數，一瓶始終置于培養箱中培養。

②補糖：發酵前期，接種 4h 后補加 5%葡萄糖 0.2ml，以后每 2h 補加 5%葡 萄糖 0.2ml 至對數生長期后期（具體時間根據菌體生長而定） 。 發酵中后期，每 4h 可加入 5%左右的葡萄糖 2ml。

③溫度：發酵前期 30℃，發酵中后期 34℃。

④細胞濃度： 發酵前期， 接種 2 小時后每小時測定一次細胞濃度至穩定期后， 再間隔 2 小時測一次細胞濃度。用血球記數板法測量菌體量及出芽率，并繪制生 長曲線。

⑤濕菌體量的計算：發酵結束，離心后，用無菌水洗滌 2 次，稱量濕菌體重。

5、蒸餾,測酒精度