RNA提取與純化

實驗概要

掌握RNA提取的基本技術，了解RNA提取過程中的各種注意事項。

實驗原理

RNA提取是分子生物學實驗中難度較大的實驗技術。
 

RNA提取和DNA提取有類似的地方，因為它們都是核酸，都具有較好的水溶性。提取RNA首先破碎細胞，然后用提取液將RNA溶出，反復抽提去除蛋白質，加入乙醇沉淀RNA，將RNA沉淀溶解備用。那么如何區分DNA和RNA分開？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的鹽溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的鹽溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它們的溶解性將它們進行區分。另外，RNA的分子量一般比較小，而DNA分子很大且和蛋白結合成復合體，所以DNA更容易隨蛋白沉淀，而RNA具有較好的溶解性。
 

RNA提取的另一個關鍵問題就是如何抑制或去除環境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和鐵器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃過夜浸泡，然后濕熱滅菌80℃烘干備用。配制溶液所需的水也要用DEPC處理過的水，而配置Tris相關的緩沖液時Tris會與DEPC發生反應，應避免用DEPC處理。另外操作過程中應戴手套。
 

判斷RNA 的質量主要有兩個標準，一是純度，二是完整性（是否被降解）。RNA的純度可以通過分光光度計進行測定的A260／A280值來判斷。RNA的完整性主要通過電泳分析來闡明，未降解的總RNA電泳時在凝膠中會出現18S和28SrRNA對應的條帶（如果有DNA污染則在RNA后會發現基因組DNA對應的條帶）。RNA電泳系統也要嚴格對RNA酶進行處理。如果用普通瓊脂糖凝膠電泳，則用盡量減少電泳時間。

主要試劑

1、暗培養7天的小麥苗，用前光照誘導3 h

2、DEPC

3、DEPC處理的ddH2O

4、RNA提取液：（每1000毫升中含有） 

    Tris   6.06 克   (最終濃度為50 mM )

      LiCl  6.03 克 (LiCl -H2O 9.06克)(最終濃度為150 mM )

      EDTA（0.5 M）  10 毫升   (最終濃度為5 mM )

      SDS             50 克(最終濃度為5 % )

5、8 MLi Cl：33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC處理的ddH2O

6、水飽和酚

7、氯仿

8、0.5M NaCl

9、溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。

10、點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍，40%甘油。

主要設備

1、分光光度計

2、電泳儀

3、臺式離心機

4、手提式紫外監測儀

5、恒溫水浴

6、凝膠成像系統

實驗材料

暗培養7天的小麥苗，用前光照誘導3 h

實驗步驟

1、取植物葉片1-3克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分裝，小量提取試劑量可減至1／10)

2、液氮揮發完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的離心管中，迅速反復倒置混勻，直至看不見任何團狀物為止。

3、立即加入10毫升的等體積（酸性）酚/氯仿，劇烈（！）反復倒置混勻5至10min（如在震蕩器上震蕩，要確保混勻而不能僅僅是振動！）。

4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。

5、重復步驟3和4，三次左右（注意觀察界面上白色物質）。

6、取上清，加入等體積的氯仿，反復倒置混勻2-5min。

7、13000g×5min。

8、取上清，加入1/3體積8 M 的 LiCl （即8 M LiCl應占最后體積的25%）， 沉淀RNA，4℃過夜。

9、離心13000g × 10 min。

10、棄上清,保留沉淀（此時應把RNA沉淀轉入Eppendorf管中，以便于操作）, 加入70%無水乙醇 30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗滌沉淀數分鐘（和緩地反復倒置混勻），離心 （13000g × 2 min）。重復洗滌沉淀數次。

11、用70%乙醇再洗滌2次沉淀，去掉鹽離子。

12、用槍頭吸去殘留的液體，真空干燥2min。

13、加入200 ul DEPC 處理過的水溶解RNA。

14、取用5 ul電泳檢測RNA完整性,  用TEB 緩沖液, 200V× 20-30min。

15、取5 ul稀釋40倍測定RNA純度和濃度，A260 nm /A280 nm應在 2.0 左右。

16、將RNA 分裝,放在-70℃長期保存備用.

注意事項

輔助方案：試劑盒提取法（Trizol）

（一）試劑：

    1.Ttizol Reagent 

2.氯仿

3.異丙醇

4.70%無水乙醇

5.DEPC  

（二）器材：

1、研缽

2、離心機

（三）實驗步驟

1、稱取小麥葉片50-100mg,于研缽中加液氮研磨成粉末，迅速轉移到1.5ml離心管中。

2、加入1 ml Trizol  Reagent，15～30℃×5min。  

3、加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 sec，15～30℃×3min。

4、冷凍離心12 000 rpm×15min。

5、將上清液轉移到另一個離心管中，加0.5ml預冷異丙醇,混勻 ，-20℃放置20min。

6、冷凍離心12 000 rpm×10min。

7、加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀，懸浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。

8、加入30 ul DEPC 處理過的ddH2O溶解RNA。