核酸探針標記

實驗概要

核酸探針根據核酸的性質，可分為DNA和RNA探針;根據是否使用放射性標記物與否,可分為放射性標記探針和非放射性標記探針;根據是否存在互補鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據放射性標記物摻入情況,可分為均勻標記和末端標記探針。

實驗原理

分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應用于轉基因植物拷貝數的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。
切口平移法(nick  translation) 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coli  DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響:  (a) 產物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA酶的用量和E.coli  DNA聚合酶Ⅰ的質量會影響產物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應使用仔細純化后的DNA。

主要試劑

(1) 10×切口平移緩沖液:  0.5M/L Tris-Cl (pH7.2)；  0.1M/L MgSO4； 10mM/L DTT；  100ug/ml BSA。

(2) 未標記的dNTP原液：除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mM/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mM/L。

(3) [α-³²P] dCTP或[α-³²P]dATP:400 Ci/mM, 10uCi/ul。

(4)E.coli DNA聚合酶Ⅰ：(4單位/ul)：溶于50ug/ml BSA, 1mM/L DTT, 50%甘油，50mM/L Tris·Cl(pH7.5)中。

(5) DNA酶:1mg/ml。

(6) EDTA :200mM/L (pH8.0)。

       (7) 10M/L NH₄Ac。

實驗步驟

(1) 按下列配比混合:

　　　　未標記的dNTP 10ul

　　　　10×切口平移緩沖液 5ul

　　　　待標記的DNA 1ug

　　　　[α-32 P]dCTP或dATP(70uCi) 7ul

　　　　E.coli DNA聚合酶 4單位

　　　　DAN酶 I 1ul

　　　　加水至終體積 50ul

 (2) 置于15℃水浴60分鐘。

 (3) 加入5ul EDTA終止反應。

    (4) 反應液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5M/L, 加入兩倍體積預冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。

注意事項

   1、³H，³²P及³⁵S標記的dNTP都可使用于探針標記，但通常使用[α^-32 P]-dNTP。

　2、DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。