表達蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

實驗概要

細菌體中含有大量蛋白質，具有不同的電荷和分子量。強陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，通過加熱使蛋白質解離，大量的SDS結合蛋白質，使其帶相同密度的負電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上，不同蛋白質的遷移率僅取決于分子量。采用考馬斯亮蘭快速染色，可及時觀察電泳分離效果。因而根據預計表達蛋白的分子量，可篩選陽性表達的重組體。

主要試劑

1、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)

2、1M Tris-HCl(pH 6.8)

3、10% SDS

4、10′電泳緩沖液(pH 8.3)

5、10%過硫酸銨（AP）1、30%儲備膠溶液

6、2′SDS電泳上樣緩沖液

7、考馬斯亮蘭染色液

8、脫色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

實驗步驟

采用垂直式電泳槽裝置

（一）聚丙烯酰胺凝膠的配制

1、分離膠(10%)的配制:

ddH2O           4.0ml

30%儲備膠       3.3ml

1.5M Tris-HCl    2.5ml

10% SDS         0.1ml

10% AP          0.1ml

取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED 4μl ,混勻后灌入玻璃板間，以水封頂，注意使液面平。（凝膠完全聚合需30-60min）

2、積層膠（4%）的配制：

ddH2O             1.4 ml

30%儲備膠        0.33 ml

1M Tris-HCl      0.25 ml

10%SDS          0.02 ml

10%AP           0.02 ml

TEMED              2 μl

將分離膠上的水倒去,加入上述混合液,立即將梳子插入玻璃板間，完全聚合需15-30min。

（二）樣品處理：將樣品加入等量的2×SDS上樣緩沖液，100℃加熱3-5min，離心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同時將SDS低分子量蛋白標準品作平行處理。

（三）上樣: 取10μl誘導與未誘導的處理后的樣品加入樣品池中,并加入20μl低分子量蛋白標準品作對照。

（三）電泳:在電泳槽中加入1′電泳緩沖液，連接電源，負極在上，正極在下，電泳時，積層膠電壓60V,分離膠電壓100V,電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止（約需3hr）。

（四）染色:將膠從玻璃板中取出，考馬斯亮蘭染色液染色，室溫4-6hr。

（五）脫色:將膠從染色液中取出,放入脫色液中,多次脫色至蛋白帶清晰。

（六）凝膠攝像和保存：在圖像處理系統下將脫色好的凝膠攝像，結果存于軟盤中，凝膠可保存于雙蒸水中或7%乙酸溶液中。

注意事項

1、實驗組與對照組所加總蛋白含量要相等。

2、為達到較好的凝膠聚合效果，緩沖液的pH值要準確，10%AP在一周內使用。室溫較低時，TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺具有神經毒性，可通過皮膚和呼吸道吸收，應注意防護。