(二)原代細胞的維持
1、貼壁細胞（包括半貼壁細胞的換液）
貼壁細胞長成網狀或基本單層時，由于營養缺乏，代謝產物增多，pH變酸，不適宜細胞生長，此時細胞還未長成單層，未達到飽和密度，仍需繼續培養，因此，需采取換液方式來更新營養成分以滿足細胞繼續生長繁殖的需要。其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養液相同的等量完全培養基。若希望細胞能在較長時間內能維持存活，但不需增殖，此時要換成含2%小牛血清的維持液。
2、懸浮細胞
凡經培養后只在細胞培養基中懸浮生長而不貼壁的細胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細胞的形態和生長現象，淋巴細胞的短期培養無需換液，但加入生長因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，細胞不僅會發生轉化而且會發生分裂繁殖，此時培養基中的營養成分并不能維持細胞的營養需求，加之代謝產物增多，pH變酸，細胞不適宜生長，需進行換液。白血病細胞或淋巴瘤細胞體外長期培養時，都需換液培養，待達到飽和密度時才能傳代。換液時，只能采用半量換液的方式，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進行換液。
半量換液的方法如下：
將原培養瓶豎起，在30分鐘內，若細胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮完全培養基。若細胞不能沉于瓶底，可吸出細胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮完全培養基，混勻后再轉入原瓶繼續培養。
二、原代細胞培養的首次傳代
原代培養后由于懸浮細胞增殖，數量增加甚至達飽和密度，貼壁細胞的相互匯合，使整個瓶底逐漸被細胞覆蓋，細胞難以繼續生長繁殖，需要進行分瓶培養，這種使原代細胞經分散接種的過程稱之為傳代。每進行一次分離再培養稱之為傳一代，傳至5～10代以內的細胞通常稱為次代培養細胞，傳至10~20代以上的細胞，通常確定為傳代細胞（或稱傳代細胞系）。然而，傳代細胞系的建立，關鍵是初代培養的首次傳代。
應注意如下幾點：
(1)細胞生長密度不高時，或未能達到覆蓋整個瓶底時不能急于傳代。
(2)原代培養的貼壁細胞多為混雜細胞，形態各異，往往是上皮樣細胞和成纖維樣細胞并存，采用胰蛋白酶消化時要掌握好消化時間，因成纖維細胞易于脫壁，上皮細胞不易脫壁，因此，可根據需要選用適當的消化時間及時中止消化。在早先傳代時，其消化時間比一般已建系的細胞相對長一些。
(3)吹打已消化的細胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可能減少對細胞的機械損傷。
(4)首次傳代時細胞接種數量要多一些，以利于細胞的生存和繁殖。如果消化分離的細胞懸液有組織塊，也一并傳入到培養瓶，盡量減少細胞損失。
(5)首次傳代培養時的pH不能高，寧可偏低一些。此外，小牛血清濃度可適當加大至15%～20%左右。
三、傳代細胞的傳代培養
原代細胞經傳代后所形成的傳代細胞，可根據不同細胞采取不同的方法進行細胞傳代。貼壁生長的細胞用消化法傳代，部分貼壁的細胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養基后直接吹打分散進行傳代，或用自然沉降法加入新培養基后再吹打分散進行傳代。后兩種傳代方法比較簡單，唯有貼壁細胞的消化傳代法比較復雜一些。
現將具體方法介紹如下：
(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養基（以25mL培養瓶為例）。
(2)每瓶加入2mL，無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。
(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02鞹A或混合液），輕輕搖動培養瓶，經消化液鋪滿所有細胞表面，待細胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現象時，倒掉消化液，再繼續作用2～3分鐘，輕輕搖動，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發現細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時應立即終止消化。
(4)加入完全培養基5mL，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時要按順序進行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現泡沫，以避免細胞的機械損傷。
(5)用計數板計數，計算細胞的濃度，并用培養基調整適當的細胞濃度后再分瓶培養。
四、傳代細胞的建系和維持
細胞系的維持是培養工作的重要內容，是通過換液傳代再換液、再傳代和細胞種子凍存來實現的，但對每一個細胞系來說都有其自身的特點，要做好建系的維持須注意以下幾點：
1.細胞檔案
細胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學特性（由形態、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等）、培養基的要求、傳代換液時間、擴增時間(分裂指數)，細胞的特殊遺傳標志(標記染色體)等，這些記錄對于保證細胞的正常生長，保持細胞的一致和經長期培養細胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。
2.換液傳代
(1)細胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規律性，因而在繼續傳代時，要注意保持其穩定的規律性，這樣可以減少由于傳代時細胞密度的頻繁增減或換液時間的不規律而導致細胞生長特性的改變，給以后的實驗帶來影響。
(2)多種細胞系維持傳代，要嚴格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉，甚至每個細胞系均需單獨實驗室，傳代時各系均分開單獨操作，每傳5代后，細胞種子均應凍存。傳代時均應作好記錄，培養瓶上要有明顯標記，標記細胞系名稱和傳代的代數及傳代時間。若細胞生長較快，可減去換液程序，每次均可傳代。每個傳代細胞系，最好能分成2～3條線，分別傳代，同時也可在適溫或4℃短期存放一瓶，以防止污染丟失。細胞種子的及時凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細胞變異，此外還可提供不同代次的細胞同時進行對比試驗。
3.細胞系（或株）的鑒定和管理
當一個細胞系（或株）建立后，專家鑒定可有可無，按國際慣例，只要認真研究，記錄完整，資料和結果確切，就可在有關雜志上或刊物上報道細胞的各次實驗指標。