4.軟瓊脂克隆分離法
本法僅適用于懸浮培養的類淋巴細胞或惡性程度高的貼壁細胞，而正常貼壁細胞在軟瓊脂中不能形成克隆。
（1）將對數生長期的細胞制成單個細胞懸液(貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成單個細胞)作活細胞計數。調整細胞濃度至1×106細胞/L，然后根據實驗要求再作梯倍稀釋。通常以1~5×104個細胞/L為佳。
（2）制備底層瓊脂 取5%瓊脂置沸水中，使瓊脂完全溶化，取出一份5%瓊脂，移入小燒杯中，待冷至50℃，迅速加入9份預溫37℃的新鮮培養液（即成為0.5%瓊脂），混勻后立即注入24孔培養板中，每孔含0.5% 瓊脂0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。
（3）制備上層瓊脂 取37℃保溫的、不同濃度的細胞懸液9.4mL，移入小燒杯中，加入50℃ 5% 瓊脂0.6mL迅速混勻，即配成0.3%瓊脂培養基，立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養板中，每孔0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。
（4）于37℃ 5% CO2下培養1~2周或更長，若需培養更長時間可補加0.8mL/孔含瓊脂的培養液，待有明顯集落形成為止。
（5）集落（克隆）計數：在倒置顯微鏡下觀察并計數直徑大于75μm或含有50個細胞以上的克隆。
5．單細胞顯微操作法
借助顯微操縱器，在顯微鏡監控下將單個細胞逐個吸出，移入含有飼養層細胞的培養板中進行培養。本法準確性好，如無顯微操縱器可自制毛細吸管替代。
方法如下：
（1）飼養層細胞的制備 單個細胞在極低密度下生長非常緩慢，甚至難以分裂，為了促進克隆細胞的生長繁殖，常采用飼養層細胞，飼養細胞種類和制備方法依實驗要求而定，現以3T3小鼠纖維細胞為例：
①用0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長的3T3細胞，調整細胞濃度為108細胞/L，在96孔板中每孔加入0.1mL細胞懸液于37℃ 5% CO2中培養至單層。
②將已形成單層的3T3細胞板，用60Co γ線以4000～6000拉得輻射或在培養液中加入絲裂霉素（終濃度為10-6mol/L）作用16h。其目的是使細胞有絲分裂能力喪失，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持pH而且還可為克隆細胞提供必要的養分及刺激生長的因子。飼養細胞處理后需更換新鮮培養液。
(2)制備單個細胞懸液 方法同上。
(3)分離單個細胞 其方法多樣，可根據實驗條件決定：
①毛細管吸入法 同上述毛細管法，在顯微鏡下將只有一個細胞的毛細管取出。
②微滴法 將經稀釋至103個細胞/L的單個細胞懸液，用無菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個細胞的液滴，再用毛細管取出單個細胞懸滴。
③液體石蠟法 將經稀釋至103個細胞/L的單個細胞懸液，用無菌的1mL注射器逐滴加入充滿無菌液體石蠟的平皿底部，在倒置顯微鏡下挑選只有一個細胞液滴，仔細用毛細吸管取出有一個細胞的液滴。
④玻璃小球附著法 將稀釋至103個細胞/L的細胞懸液加入表面涂有無菌凡士林石蠟的小玻璃珠的平皿中，混勻后，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個細胞的玻珠，仔細用鑷子取出。
(4)將采用上述方法分離出的單個細胞，放入預先制備飼養層細胞的96孔培養板中，于37℃ 5% CO2下培養1~2周或更長。
(5)待細胞克隆明顯，并使孔底覆蓋1/3～1/2時，即可將細胞轉種于24孔板進行擴大培養（貼壁細胞仍需用0.25%胰酶消化法取出轉種）。