其他研究組也對影響計數結果的因素進行了廣泛的檢查，如通過提供統一試劑或發行標準分析方案來進行。盡管這些研究減少了一些檢測差異，但要進一步地提高實驗的精確性需對各個檢測中心進行全面的培訓并發展標準的計數方案。此項工作由Nordic Myeloma研究組廣泛開展，他們組織了兩個協作組來制定計數標準方案并在24個實驗室中進行來提高CD34計數的準確性。第一次協作工作主要集中于標準化標本處理方法；其間制定了一樣本處理的標準方法：要求樣本在4小內分析；使用Ortho溶血劑與標本孵育8至10分鐘溶血；5-10 x 105細胞與克隆號為HPCA的PE標記的CD34抗體室溫下孵育15分鐘，同型對照同等條件處理；洗滌2-3次后用150ul 1%的多聚甲醛固定。用米蘭方案識別低SSC信號的CD34陽性細胞，共分析50000個完整細胞，并減去同型對照陽性顆粒的數量。
在第二次協作中，Nordic首先向參與單位分發了含有三個病例List mode數據的磁盤供分析。發現在參與單位之間的分析結果差異很小（如對于含有0.29%和1.36%的兩個樣的標準差分別為0.04和0.17）。隨后參與單位又收到了先染色后固定的和還未染色的兩種樣本。隨后對24家參與單位的22家結果分析表明結果比較一致（r>0.9），盡管其中有實驗室一直報告較高或較低值。在三階段中，參與單位要求使用第一次協作中制定的標準方案來檢測送檢樣本。結果顯示CD34計數的平均值為0.68%，標準差為0.08。使用更為統一的方案來檢測下一標本時，其平均值為3.0%+0.26，范圍是2.6-3.3%。最終的推薦方案是：溶血步驟可在染色前或染后進行；加與不加鼠IgG來封閉非特異染色不影響結果；如果檢測中發現有非特異性染色，則需阻斷后再進行檢測；無需對樣本進行過濾；孵育與分析之間樣本最好只洗滌一次。為了絕對計數CD34細胞，需對樣本進行10倍稀釋后進行白血胞計數。
應用標準化方案來計數CD34細胞在Benelux的研究中進一步被證實。實驗室之間在未用標準方案前的檢測變異系數34-106%在應用標準方案后下降至18-30%。錯誤應用方案后，變異系數又增加至50-82%。
這些研究表明，在CD34計數檢測中有眾多因素影響著計數的準確性。這些因素可通過以下操作步驟來去除這些影響：1，盡量減少對樣本處理步驟；2，使用適當標記的抗體；3，選擇適當的陰性和陽性標本；4，收集足夠的細胞數來降低變異系數；5，采用標準設門和分析方案。但以上任何一條現都沒國際上通用的標準，很清楚我們需要為CD34干細胞計數設立一廣泛同意的標準來減少其中的變異性。現將一些標準總結如下。
樣本準備
現有很多種方法運用于干細胞計數的樣本準備及分析中。在早期研究中，細胞經常經Ficoll淋巴細胞提取液來富集單個核細胞，然后反推外周血或采集品的細胞比例。這種計算方法經常會得出不精確的評估數據，但能部分地反映標本中的細胞量。Fritsch報道單個核細胞分離操作會導致外周血中26%的、骨髓中21%的、采集品中5%的CD34+細胞丟失。現在基本棄用單個核細胞富集法，而改用對全血進行溶血來去除紅細胞。在這個操作步驟中，在未經處理的標本中直接加入熒光標記的CD34抗體進行染色，通過加入溶血劑溶解紅細胞的步驟可在染色前或染色后進行。這樣使經血球儀計數的白細胞數與流式細胞儀經CD45設門后計數的白細胞數更容易比較。一個對不同樣本處理技術的系統比較發現洗滌步驟會導致部分白細胞群體丟失，從而造成CD34+細胞的過量計數。這種過量計數可通過在溶血后計數白細胞作為分母計算而非在溶血前來糾正。溶血后不洗方法可保存樣本中各種白細胞群體，但這樣會改變細胞的光散射信號并增加熒光的非特異染色本底。這樣就會導致底估CD34+細胞絕對計數。盡管每種標本處理方法都有其不足之處，但本研究推存使用：先裂解紅細胞；洗滌樣本；進行白細胞計數作為計算分母；最后進行染色步驟。在本研究中，筆者使用不含固定劑的氯化銨溶血劑（Ortho公司）室溫下溶血5-10分鐘，隨后洗滌2次后染色。對于先染色后溶血的樣本，要求白細胞數在2000-3000/ul，這樣可避免因樣本量過大而造成染色和分析時間加長；樣本在此法處理后無法再進行白細胞計數。相比而言，溶血/洗滌法可預先獲知樣本的白細胞數并能夠分析原樣中白細胞含量小于50 /ul的樣本。
溶血劑
通過對不同溶血劑（FACS Lysing solution Bection Dickinson; Immunolyse Beckman-Coulter; Optilyse B Immunotech, ImmunoPrep Beckman-Coulter；OrthoMune Ortho; ACK BioWhittaket）的比較發現它們的效果各不相同。各染血劑溶血后CD45陰性碎片占總顆粒數百分比為：ACK，Immunolyse: 80%；其他溶血劑大約為50%。Optilyse和FACS溶血后淋巴細胞比例最低，當使用ACK和OrthoMune后CD4和CD8陽性細胞比例不穩定，但所有的這些溶血劑都能使CD34陽性細胞明顯地與陰性群體相區分。對于溶血及固定型試劑的檢測也得出了相似的結論。這些觀察結果顯示溶血劑并不象我們所認為的對CD34+細胞計數無影響。要避免延長溶血時間，除非標本已置于冰上停止了溶血。
樣本問題
有些樣本可能存在某些特殊問題。血小板可能會與CD34+或CD34-細胞結合影響精確計數。這個問題可通過增加EDTA來解決。聚集的血小板可能會與CD34、CD45抗體微弱結合，但可通過巧妙的設門方案將其去除。
樣本的儲存及運送
越來越多的采集品因要合并或體外富集或要被運送至流式檢測中心，樣本都需被過夜保存。在以上這種情況下，樣本中細胞群的活性和被分析細胞潛在的改變等問題逐步顯現出來。現在對這些細胞最佳的存儲及運輸條件現在還未明確地建立。各個實驗室對標本保存溫度從室溫至4℃不等；加或不加營養劑都有。不同的標本盛放容器和一些與血小板集聚有關的因素現已被嚴格限定。Gutensohn報道采集品在室溫下保存24小時后，用HPCA-2和QBEND10兩種克隆號的單抗檢測發現CD34+細胞分別下降了25.4%和27.0%。樣本在運輸過程中的晃動會增加大概10%的抗體非特異性染色，主要是由髓系細胞和死細胞造成的。相對而言，如標本儲存在4℃條件下，CD34+細胞不會有明顯下降。盡管現在低溫運送標本已變得可行，但一些冷凍劑會影響細胞表面抗原的表達。Rosillo等人報道當髓細胞暴露在DMSO中時會使細胞下調表達CD7，CD13，CD33和CD34并且也影響一些其他一些抗原表達強度。但Farley卻得出了不同的結論，他發現冷凍劑即不影響細胞的光散射屬性也不影響細胞標本中CD34+細胞的比例。現在由于樣本被廣泛運送檢測加之缺乏適當的標本儲存和運輸知識，又一些抗體會與死細胞起非特異結合，要求對樣本進行活性檢測來去除細胞中的死細胞。可用的試劑有PI、7-AAD或LDS-751。
CD34抗體的選擇
對于CD34抗體及其熒光素的選擇現還有爭論。最初因缺乏直標的CD34抗體，采用未標記的CD34抗體與FITC標記的熒光二抗來間接檢測。這樣一來使原本復雜的檢測與二抗的非特異結合和如何識別陽性細胞等問題摻雜在一起，更難以處理。隨后一系列不同熒光素標記的CD34抗體的出現使以上情況有所改觀。這些抗體能與CD34抗原的I、II、III類位點結合，CD34的不同抗原位點可根據其對不同的蛋白水解酶的敏感性來區分。對Vibrio cholera神經氨酸苷酶和Pasturella hemolytica起源的糖蛋白酶敏感的稱之為I類位點，針對此位點的抗體克隆號有：MY10，B1.3C5，12.8和ICH3。對唾液酸不敏感但能與PhG粘附的稱之為II類位點，識別此位點的抗體是QBEND10。對以上幾種酶都耐受的，稱之為III類位點，可被8G12、TUK3、115.2等克隆號的抗體可識別。
使用III類位點特異性抗體能最大限度地提高檢測的敏感度。這是因為抗體與熒光素結合后，其結構可能會發生改變從而導致一些抗體無法完全檢測某些樣本中的CD34+細胞。基于以上情況，發現針對I類抗原的抗體此問題最為嚴重，它在與熒光素結合后，如FITC，即失去活性；此外還發現這些抗體與PE熒光素結合后其特異會嚴重下降。相對而言，PE標記的II類抗原能夠檢測樣本的所有CD34+細胞，但它一旦與FITC結合后也會喪失一部分結合能力。使用抗II，III類位點的抗體計數采集品與臍帶血中CD34+細胞，發現其相關性系數為0.975。現普遍推廣使用與III類位點結合的抗體，這些抗體能有效地與多種熒光素結合如：FITC、PE、PerCP、APC和PE-CY5。任何標記的抗體都要仔細觀察其是否會有潛在的交叉反應，此外還要注意它們可能會與某些樣本中聚集的血小板結合。
對于II類位點的抗體在計數骨髓或外周血中CD34+細胞時，其有效性評價不一。有報道認為QBEND10抗體因其與死細胞的結合而增加非特異性染色且與目標細胞的結合強度也不高，所以它不適合作干細胞計數。但FITC標記的抗體確實存在以上情況，FITC標記的抗體陰性檢測結果就能說明這種情況，而PE標記的抗體則正常。
陰性對照
干細胞計數中另一個難點是如何選擇一個恰當的陰性對照。一般在流式細胞儀上，選用與抗體標記相同的同型免疫球蛋白作為非特異性染色的本底，但這種方法沒有體現針對具體抗原的非特異性染色的情況。在用CD34抗體染色的標本中，目標細胞群可能少于總細胞群的0.1%；而只有目標細胞群大于1%時才合適用同型作為陰性對照，這樣就很難區分檢測管中的陽性細胞是特異性染色或非特異性的。
另一種可選方案是采用多參數設門技術來區分特異性結合群體。通常CD34陽性細胞同時也表達CD45，并且這些細胞的光散射信號也有其特征。在CD45/SSC雙參數圖中，CD34陽細胞與淋巴、單核、粒細胞相分離獨立成群。平行對比實驗發現用多參數設門檢測的陽性細胞中不含有熒光標記的同型對照陽性的細胞。實驗表明多參數檢測或結合邏輯設門將成為一標準，特別是在運用定量技術檢測特殊的染色細胞群體時。這個方案要檢測樣本中的極少數細胞群時顯得格外重要。
有學者建立了另一陰性對照方案，他將已與未標記的CD34抗體孵育后的標本再與熒光標記的CD34抗體孵育，此時陽性的細胞則算為非特異性染色。但考慮到未標記的CD34抗體也存在非特異性染色，可能會覆蓋標記抗體的非特異性染色。此法還未與同型對照作過比較。
陽性對照
在臨床檢測中需要檢測陽性樣本，據此來檢查操作過程是否正確，并可作為質控。在CD34檢測項目中，要取得易制備、穩定可靠的陽性標本并非易事。現有幾種制作方案被實驗室接受。陽性標本一般使用各種表達CD34抗原的細胞株來制備。運用最廣的是KG1這強陽性表達CD34的細胞株，當它被加入至臨床樣本中時，不會影響原樣本中的各細胞染色屬性（Coulter和R&D公司的質控試劑使用的就是這種技術）。由于這些細胞形態較大有其特有的光散射屬性，它們作為CD34+細胞加入未動員的全血中并不能很好的模擬真實的樣本，從而使檢測質控樣本的方案不能適用臨床樣本。雖然有可能從一個長期志愿者身上抽取樣本作為質控，但由于無法得知其真正的陽性細胞數，又該法很難常規單位實行所以并不理想。以上問題可通過收集同一個具有高和低CD34+細胞數病人的標本，將其分裝后凍存。凍存后的樣本在光散射信號與CD34表達上與新鮮樣本比較一致。每天可檢測一管解凍扣的樣本作為陽性質控品。當使用這些樣本作質控時，要檢測樣本中細胞活性并要使用多參數方案來減小差異。
在美國，臨床實驗室中的操作技能考核也要同時進行，這些考核標準由若干家研究機構的臨床流式實驗室共同制定，其包括College of American Pathologists和PTP。這些測試是在正常樣本或白血病樣本上進行的，而不使用CD34+的血細胞樣本。這是由于各個實驗室對CD34+細胞計數報告的給果差異實在太大，又不能找到大批量、穩定的、已了解清楚的樣本來進行考核。如能夠制備出抗原染色穩定、適用面廣、儲存方便、使用效期長的質控品，則以上問題可得到解決。如以上任務能達成將能加速發展能減少實驗室間與實驗室中變異的實驗技術。今后或許可使用流式標準微球來達成此目的。
樣本獲取
另一個值得注意的問題是在干細胞計數中要分析多少個細胞。傳統實驗中，如分析目標在白細胞群體中，一般采集5000至10000個細胞分析。但當進行CD34干細胞計數時，由于CD34+細胞一般只占1%整單個核細胞，固可將其視作泊松分布曲線，如要得到一個變異系數為10%左右值，就要采集100個陽性細胞；采集的細胞數量要根據CD34細胞的比例來決定。盡管理想狀態下，應對每個樣本采集盡可能的細胞進行分析，但鑒于標本細胞的數量、流式所有軟件的功能、和數據的存儲空間等因素的限制而無法做到。普通實驗室一般在未設門的光散射圖中收集50000至75000個細胞進行分析，來獲得一個比較精確的結果。在分析過程可通過設門排除死細胞，但一旦去除這些細胞會使其后所分析的細胞群體數量減少。
數據分析
如上分析所見，要檢測陽性細胞需要進行雙參數或多參數分析。后者多參數分析有助于排除樣本中CD34弱表達群體，其可能包含細胞碎片或其他非干細胞顆粒。許多實驗室還加檢了CD38、CD33和CD90來進行一步計數更為原始的干細胞，或來尋找與臨床移植效果更有相關性的細胞群體。這種分析要求流式操作者具有更多的操作和統計技巧。現有很多分析方案可用于此目的；其中一些是基于原來米蘭方案修改而來，它是通過CD34/SSC設門去除細胞碎片、紅細胞和聚集物；陽性顆粒需要滿足：CD34陽性表達，SSC信號較弱，細胞獨立成群。有學者使用7-AAD染色去除死細胞，用CD14去除單核細胞的方法來分析。首先設門選取7-AAD陰性的細胞，并將其顯示在CD34/CD14雙參數圖中并從中去除單核細胞；在此方案中，可將CD34陽性細胞再次顯視在CD34/SSC圖中分析并與相應的同型對照作比較。隨后對于以上方案又有修改，將CD45替代7-AAD設立白細胞門，后進行分析。
ISHAGE方案
Sutherland于1994年在它的研究使用與以方案相似的手段分析，隨后此方案被ISHAGE收錄作為推薦方案使用，旨在確立一個普遍通用的、可排除實驗室中或實驗室間差異的方案。這個方法是由門不斷累加來完成的。第一個門是基于CD45/SSC雙參數圖上的；通過對其設門可去除紅細胞、碎片、和聚集物，這些干擾在造血細胞樣本中尤為多見，特別是在樣本使用溶血-免洗法處理后。通過此步驟也為以后計算CD34陽性細胞比例提供了可靠的分母（總白細胞數量）。在R1門中，最少要包括75000個細胞，并在R4門要計數超過100個CD34陽性細胞。將通過R1門獲取的細胞顯示在CD34/SSC雙參數點圖，在此圖中設立R2門并調節其位置包含所有CD34強陽性或弱陽性的并SSC信號弱及中等的細胞。建立一CD45/SSC雙參數點圖，將以上CD34陽性細胞顯示于其中；在其中設門R3門去除CD34陽性顆粒中的聚集血小板、淋巴細胞和單核細胞。將R3門中圈定的細胞顯示在FS/SS圖中以檢測細胞是否落在平時的幼稚淋巴細胞門R4中，通過R4要去除比淋巴細胞小的顆粒。（注：如何確定R4門的位置呢？方法如下：在CD45/SSC雙參數點圖中設立R5門圈定CD45強陽性且SSC低信號的淋巴細胞群體，將R5門中的細胞顯示在R4門所在的FS/SS雙參數直方圖中，根據其中的淋巴細胞的位置調節R4門，確定R4
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