◆ TUNEL 與 ELISA 檢測凋亡的方法比較
TUNEL法
細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用.
ELISA法測細胞凋亡
細胞凋亡時，Ca2+,Mg2+離子依賴的內源性核酸內切酶將雙鏈DNA從各核小體間連接區裂斷，產生單或寡合苷酸小體，各核小體的DNA與核組蛋白H2A,H2B,H3,H4形成緊密的復合物而對內源性核酸酶有抵抗使之不被內源性核酸酶裂解。主要使用單克隆抗DNA抗體和抗組蛋白抗體直接檢測DNA和組蛋白。
◆ 幾種檢測凋亡的方法
一、形態學觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。
2、丫啶橙（AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。
二、DNA凝膠電泳
（一）、檢測原理
細胞發生凋亡或壞死，其細胞DNA均發生斷裂，細胞內小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質內出現DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180－200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死細胞區別。
（二）結果判斷
正常活細胞DNA 電泳出現階梯狀（LADDER)條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續性條帶。
三、酶聯免疫吸附法（ELISA)核小體測定
凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。
（一）檢測步驟
1、將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體’
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合‘
4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合’
4、加酶的底物，測光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高，可檢測5*100/ml個凋亡細胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定凋亡細胞發生的絕多對量。
四、流式細胞儀定量分析
（一）檢測原理
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。
（二）應用價值
流式細胞儀檢測具有以下特點：
1)、檢測的細胞數量螅虼似浞從橙禾逑赴牡蟯鱟刺冉獻既?BR>2)、可以做許多相關性分析
3)、結合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期
■檢測形態學及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（PI)而呈強的紅色熒光。
■DNA片斷原位標記法
凋亡細胞DNA片斷原位末端檢測技術是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT)相反應與凋亡細胞裂解后3·的羥基（－OH）端結合，經顯色反應后檢測DNA裂解點的技術。
DNA片段原位標記法有二種：
1、原位缺口轉移（in situ nick-translation,ISNT)技術，它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3·－OH端
2、原位缺口末端標記技術（in situ end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT將標記的DUPT接到3·-OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠高于ISNT，尤其對早期凋亡的檢測，TUNEL更為合適。
■檢測細胞膜成分變化的Annexin V 聯合PI法
1、原理：在細胞凋亡早期位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS)遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它于PS具有高度的結合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂酰絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時結合使用PI拒染法（因壞死細胞PS亦暴露于細胞膜外測，且對PI高染）進行凋亡細胞雙染法后用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。
2、結果判斷：正常活細胞Annexin V 、PI均低染；凋亡細胞Annexin V高染、PI低染；壞死細胞Annexin V/PI均高染。
3、應用價值：細胞發生凋亡時，膜上的PS外露早于DNA斷裂發生，因此Annexin V聯合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯合PI法更加省時，結果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。
◆ 幾點參考
1.大部分凋亡細胞可能并不見得有非常典型的凋亡表型，如電鏡的染色體邊集、凋亡小體等，DNA電泳也不見得都有DNA ladder，但對某些指標來說還算穩定，如PI染色及TUNEL法，所以如果某個方法效果不好，可以換用其他方法檢測
2.壞死與凋亡的區分傳統上認為是無序與有序的過程，樓上所說的線粒體腫大也是以前的一個傳統認識，但現在有很多人認為壞死的發生也是有序發生的，因此也有了程序化壞死一說，在很大程度上，由于凋亡是時間依賴性的過程，細胞發生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期與壞死進行區分是困難的，而且我認為如果不是對于凋亡或是壞死本身通路進行研究的話，強行區分是沒有意義的
◆細胞凋亡檢測技術與方法
細胞凋亡（Apoptosis），又稱細胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。細胞凋亡概念提出至今還不到30年的時間，但由于它在保證多細胞生物的健康生存過程中扮演著關鍵角色，對個體的正常發育及細胞凋亡紊亂在病理學研究中的重要作用，引起了人們對其機制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學界最為熱門話題之一，也是生命科學界乃至社會各界爭相投入的研究領域。從近年的SCI排名中我們可以看到，信號傳導方面的文章遠遠超過位于第二位的人類基因組方面的，而信號傳導中一個重要的前沿領域就是細胞凋亡的研究。隨著這方面研究的持續升溫，涌現出了大量新的技術和方法對細胞凋亡進行檢測，其中不少已經有商品化的產品出現，大大加速了研究的進程。具體來說，針對凋亡的不同階段有以下一些方法（概括如圖1）：
1． 早期檢測:
1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測:
PS從細胞膜內側轉移到外側在細胞受到凋亡誘導后不久發生, 可能作為免疫系統的識別標志。AnnexinV，一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能專一性的結合暴露在膜外側的PS，再通過簡單的顯色或發光系統進行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測（懸浮細胞和貼壁細胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發展階段。
美國著名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發了多種標記的Annexin V產品，簡便快速，10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，靈敏度高，可作為FACS（流式細胞分選）方法篩選凋亡細胞的基礎。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的結合比例為1：1，還可進行定量檢測。除此之外，還提供生物素偶聯的Annexin V，可通過常用的酶聯顯色反應來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細胞。
2）細胞內氧化還原狀態改變的檢測：
這反應了細胞凋亡研究中相對較新的趨勢，研究什么樣的氧化還原環境引起下游事件的發生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過熒光染料monochlorobimane(MC 體外檢測凋亡細胞細胞質中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細胞內氧化還原狀態的變化。
正常狀態下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中，細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉移系統。當細胞內GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。
由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關，此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如：HeLa 和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。
3）細胞色素C的定位檢測
細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液，結合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟動caspase級聯反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。
細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在線粒體內膜上的膜蛋白，凋亡發生時，它保留在線粒體內，因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標志。
ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進一步通過Western雜交用細胞色素C抗體和COX4抗體標示細胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發生。
4) 線粒體膜電位變化的檢測：
在凋亡研究的早期，從形態學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機制研究的深入，發現線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分，發生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導后線粒體轉膜電位會發生變化，導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，發出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細胞液中，發出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區分細胞凋亡或其他原因導致的線粒體膜電位的變化。
2． 晚期檢測：
細胞凋亡晚期中，核酸內切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。對于這一現象的檢測通常有以下兩種方法：
1） TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）
通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP （多為dUTP）間接（通過地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果。美國Intergen公司提供多種標記方法，直接熒光標記，地高辛介導熒光標記或過氧化物酶聯顯色，可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。其中，直接標記步驟少，操作簡便。而間接標記有信號放大的作用，檢測靈敏度高。
2) LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)
當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR（ligation-mediated PCR）,連上特異性接頭，專一性地擴增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。
上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。
3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)
這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重復序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率