二、細胞凋亡的細胞化學測定
細胞凋亡的細胞化學測定包括細胞表面（細胞膜）的結構和通透性改變的測定和細胞核DNA改變的測定。根據應用的范圍，又可分為細胞群休和單個細胞測定兩種，以下僅介紹其中幾種較為常用的方法。
碘化丙啶（propidium iodide,PI）檢測
早期死亡細胞膜通透性狀態的不同是區分細胞凋亡和壞死的一個重要指標，凋亡細胞在進入最終溶解階段前，胞膜通透性無明顯改變，相對分子質量大的與DNA結合的熒光染料（如PI)不能時入凋亡細胞內，而相對分子質量小的熒光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被細胞攝取。應用流式細胞儀或熒光顯微鏡可區分和壞死細胞，細胞內DNA出現Hoechest 3342標記而不出現PI標記的為凋亡細胞。
檢測方法：獲取11×106細胞/ml的細胞懸液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，進行流式細胞儀分析或熒光顯微鏡觀察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外線激發，前者熒光為紅色（620nm）,后者熒光為藍色（480nm）。正常細胞藍色最強。早期凋亡細胞由于DNA的漏出藍色稍弱并有少量的紅色熒光，晚期凋亡細胞紅色熒光加強。壞死細胞紅色熒光最強。
膜聯蛋白（annexin）V標記
正常細胞的細胞膜磷脂分布是不對稱的，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）位于細胞膜內側，在細胞凋亡時轉至細胞膜外表面，這一改變被認為是特導性的，并且可作為凋亡細胞表面改變的標記。PS表面化發生于凋早期，其機制尚不清，可能是一種導致機體吞噬凋亡細胞的信號。膜聯蛋白V是Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對PS具有高度親和力，熒光標記的膜聯蛋白V與細胞表現PS結合，再用顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，可以觀察凋亡過程中細胞膜PS的表面化。結合PI染色進行雙參數檢測尚能區分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞及壞死細胞。正常細胞膜聯蛋白V（-）PI（-），早期凋亡細胞膜聯蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡細胞和壞死細胞膜聯蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜聯蛋白V標記僅有不到三分之一的凋亡細胞出現陽性標記，其原因尚不明。同時需注意度的是凋亡后期溶解階段，細胞碎片也可出現明顯的陽性著色。
檢測方法：1×106細胞/ml細胞懸液，先后用膜聯蛋白V--FITC及PI染色，流式細胞儀分析，獲得由四個象限組成的細胞直方圖（cytogram），每個象限的細胞數目就是在檢測細胞總數在所點的組份。左下象限代表正常細胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡細胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡細胞和壞死細胞（An+PI+）,左上象限代表細胞收集過程中出現的損傷細胞（An-PI+）。用生物素標記膜聯蛋白V還可以作體內試驗。將生物素標記膜聯蛋白V注射小鼠體內，30分鐘后處死，迅速取出要研究的組織置于甲醛內固定，然后，常規石蠟切片，脫蠟、水化，用親和素標記的過氧化物酶程程序孵育，DAB顯色，光鏡下觀察凋亡細胞。
DNA瓊脂凝膠電泳法
細胞凋亡時，在內源性核酸內切酶的作用下，DNA在核小體間被切割成180-200bp整數倍的單或寡核苷酸片段，在電泳時表現為特征性的“梯形帶”。自Wyllie把內源性核酸內切酶降解產生“梯形帶”與細胞凋亡相聯系以來，“梯形帶”被作為細胞凋亡的一個重要的生化指標。盡管有報道指出，實驗中出現典型的形態改變時可不伴有核小體間的DNA降解，對這一指標提出質疑，本方法仍被廣泛應用。但此方法敏感性不高，大量凋亡細胞同時存在時才出現典型的結果，且只能被用于細胞群體，不能用于組織的原位檢測。
檢測方法：培養細胞清洗、離心，加入細胞裂解液裂解，高速離心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已錠的1％-2％的瓊脂糖凝膠的樣品的孔中進行電泳，最后在紫外線燈下觀察和攝影。
DNA裂解的原位檢測
在細胞水平檢測DNA裂解的原位標記技術已越來越多地被用于組織切片和培養細胞，細胞凋亡時，由于DNA的裂解，形成單或寡核小體的雙鏈相對分子質量小的片段及在相對分子質量大的DNA上形成單的繼裂（缺口，nick）。此類斷裂可用生物素、地高辛或熒光素標記的核苷酸在3`-OH端予以顯示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脫氧核苷酸轉移酶（TdT），前者使核苷酸結合于缺口，需要模板存在，標記方法通常被稱為“原位缺口平移”(insitu nick translation,ISNT),后者使核苷酸在雙鏈的斷端延伸，不需要模板的存在，其方法被稱為未端記（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的應用已很廣泛，其優點是可用于原位標記，可用于病理組織，并可進行定量分析。值得注意的是壞死期由于內源性核酸內切酶和蛋白質酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出現 陽性反應。組織或細胞外理不當時可出現假陽性。因而，TUNEL等方法對凋亡細胞的標記是選擇性的。而不是特異性的，TUNEL或其他DNA裂解原位標記的分析應結合陽性細胞的形態，尤其是核的特征，細胞的分布和有無炎癥反應，除外非凋亡的陽性反應。
檢測方法：石蠟切片常規脫蠟、水化，蛋白質酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，顯色（辣根過氧化物酶標記可用DAB顯色，堿性磷酸酶標可用NBT+BCIP顯色），復染，脫水，封片。凋亡細胞核呈現藍色（NBT+BCIP顯色）或者棕黃色（DAB顯色）。
凋亡蛋白質酶（Caspase）-3及其底物的檢測
凋亡蛋白質酶是一類半胱氨酸蛋白質酶，具有特異性水解底物分子天冬氨酸（Asp）殘七C端肽鍵功能，是近年隨著調亡研究的深入而發現的重要凋亡分子。迄今已有13個分子得到命名，分別為凋亡蛋白質酶1-13。基中凋亡蛋白質-3是被認為在多種組織、細胞類型中最常涉及的凋亡效應分子。活化的凋亡蛋白質酶-3僅在凋亡細胞中發現，因此，檢測凋亡蛋白質酶-3的活性有助于發現早期的凋亡細胞。一般采用人工合成四肽熒光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白質酶-3在D與AMC之間水解，釋放熒光物質、AMC，后者在紫外線激發下發出波長為430-460nm的熒光，通過流式細胞儀或分光光度計對其強度進行定量，從而測定凋亡蛋白質酶-3的活性。由于醛對凋亡蛋白質酶-3的水解活性抑制作用，因此同時加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白質酶-3對DEVD-AMC的水解，不產生熒光。這樣的抑制試驗可作為對照，使凋亡蛋白質酶-3的活性分析更有特異性。但是，上述方法不適用于組只切片，因此有人嘗試采用針對活化的凋亡蛋白質酶-3亞基的抗體，通過免疫組化顯示凋亡細胞，然而其敏感性及特異性尚不能令人滿意。
檢測方法：培養細胞（也可以預先作凋亡誘導并在不同時段收集細胞）在裂解液內裂解、離心、去上清液。加入凋亡蛋白質酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同時用不加底物的樣品作對照，流式細胞儀檢測，加有底物的樣品釋放出的熒光強度樣對照樣品明顯增強。如加入DEVD-AMC時再加入DEVD-CHO，樣品釋放的熒光強度與對照樣品無差異。
凋亡蛋白質酶-3導致細胞凋亡是通過水解或滅活一些細胞關鍵蛋白質實現的，因此檢測凋亡蛋白質酶-3底物的改變也有助于辨認細胞的凋亡。PARP是第一個被認識的凋亡蛋白質酶-3底物，它的相對分子質量為116000，水解后形成相對分子質量為85000及相對分子質量為25000的兩個片段，用運載相對分子質量為85000片段的抗體可以觀察細胞是否發生凋亡。細胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白質酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸殘基形成一個新的抗原表位，用抗此表位的抗體可以在組織切片上辨認凋亡細胞。另外一種細胞骨架蛋白質肌動蛋白（actin）被水解后產生一種稱為“fractin”的片段，在凋亡早期出現，并認為與細胞膜的起泡有關，可能有助于早期凋亡細胞的辨認。總之，隨著對凋亡蛋白質酶及其底物的進一步研究，將會發現更有價值的有助于檢測凋亡細胞的方法。
三、展望
除了以上介紹的幾種較常用檢測細胞凋亡的方尖，還有一些尚未被列入的檢測方法，新的方法正將出現。盡管用于檢測細胞凋亡的方法較多，但形態學觀察，尤其是透射電鏡觀察仍具有不可替代的作用，只是其應用受到一定限制。在細胞化學檢測方法中，迄今沒有任何一種方法具有足夠的敏感性和特異性，尤其在病理組織中要作出準確定量分析仍較為因難。在目前情況下標本和病變的特點，選擇多種適當的方法進行綜合檢測，常可行到較準確結果，同樣重要的是，要充分理解各種方法的原理及應范圍，并對結果作出合理的分析和判斷。隨著對細胞凋亡認識的深化和有關技術的進展，期待更敏感、更特異的方法面世，這對于病理狀態（包括腫瘤）中細胞凋亡的研究將具有重要意義。
◆ 有關細胞爬片
1. 處理細胞爬片：用滅菌的去離子水將多聚賴氨酸配成0.1mg/ml,處理載玻片過夜即可。用前再用去離子水漂洗一次，就可直接接種細胞！
2. 熱療對細胞內熱休克蛋白70的誘導
陳必良1，安曉汾2，辛曉燕1，王德堂1，郭慧玲1（1第四軍醫大學西京醫院婦產科，
陜西西安 710032；2第四軍醫大學吉林軍醫學院附屬醫院婦產科，吉林省 吉林市，132011）
【摘要】目的 探討腫瘤細胞（以人卵巢癌細胞為例）在受熱不同時間、不同間隔后細胞內熱休克蛋白70表達的異同；明確人卵巢癌細胞對熱耐受的敏感程度。方法 體外培養人卵巢癌細胞HO-8910，制成細胞爬片。加熱溫度設為42℃，實驗分成兩部分：①加熱時間分別設為15、30、60、90、120、150min，加熱后立即固定細胞；②將細胞加熱120 min后，置于37℃細胞培養箱中復溫不同時間，收集復溫后1h、4h、6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h后的細胞爬片固定。然后將兩組細胞爬片行HSP70的免疫組化染色，觀察熱療前后HSP70的不同表達。結果 未加熱細胞僅有少量HSP70的表達，隨加熱時間延長，HSP70的表達逐漸增多；加熱后不同間隔HSP70的表達不同，間隔6 h HSP70的表達最強，隨后逐漸減少，5-6天后，恢復至未加熱狀態。結論 ①溫和加熱時間過長可誘導HSP70的大量產生，從而使腫瘤細胞對熱療產生熱耐受作用; ②卵巢癌HO-8910細胞對加熱有較強的耐受性。
關鍵詞：熱休克蛋白70；免疫組織化學；熱耐受；卵巢癌；
隨著科學技術和醫學科學的發展，對癌癥的診斷和治療有了長足的進步。高溫治療也稱熱療（hyperthermia，HT，又叫溫熱療法）,以其無手術痛苦、無術后并發癥及無化療及放療帶來的副反應而發展成為癌癥治療的有一種有效方法[1]。高溫可導致腫瘤細胞死亡或者生長抑制，同時高溫還可提高腫瘤細胞對化療和放療的敏感性，因為腫瘤細胞對于高溫的敏感性明顯高于正常細胞。但在應用過程中也發現，隨熱療重復次數的增加，熱療效果反而下降，會出現所謂“熱耐受（thermotolerance）”現象，即第1次加溫可影響第2次加溫的生物學效應。這說明在熱療過程中，腫瘤細胞內生成了某些物質可降低其對熱的敏感性。研究表明[2]，該現象與熱休克蛋白家族尤其與熱休克蛋白70（HSP70）的關系密切。本研究利用人卵巢癌細胞HO-8910受熱后進行HSP70免疫組化染色，以了解在該細胞中HSP70的表達與加熱之間的關系。
1 材料和方法
1.1 材料 人卵巢癌細胞系HO-8910為分化差的卵巢漿液性囊腺癌細胞，由第四軍醫大學西京醫院實驗室提供。HSP70成套免疫組化試劑盒（產品編號 SA2077）及DAB顯色試劑盒（產品編號 ED1022）均購自武漢博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 加熱處理 將細胞接種于含熱滅活的15%小牛血清及雙抗的RPMI1640 (Gibco BRL,USA) 培養液中，常規培養。取對數生長期的細胞，經0.25%胰酶消化后制成細胞懸液，細胞密度為1×105/ml。將1cm×1cm 大小的蓋玻片置于24孔板中 ，每孔加入1ml的細胞懸液，制成細胞爬片。12 h后，將24孔板置于42℃培養箱中分別進行兩種實驗處理：①加熱時間分別設6個時間點，即15、30、60、90、120和150 min，加熱后的細胞即刻用0.01M PBS洗滌2次 ，用4%多聚甲醛固定細胞40 min，制成細胞爬片后置于4℃冰箱中保存備用；②將細胞加熱120 min后，置于37℃細胞培養箱中復溫不同時間，收集復溫后1、4、6、12、24、48、72、96、120及144 h后的細胞爬片按照上述步驟處理細胞固定后備用 。
1.2.2 HSP70表達的免疫組化染色檢測 將細胞爬片置于3% H2O2中室溫孵育10 min，以蒸餾水洗滌后次滴加正常山羊血清封閉液室溫放置20 min、滴加小鼠抗HSP70的抗體37℃ 1 h、滴加二抗及試劑SABC室溫下各放置20 min，最后以 DAB顯色, 染色時間統一設為5 min后終止。再經 蘇木素輕度復染、常規脫水、透明和封片后，于顯微鏡下觀察并照相。陽性細胞胞漿/胞核染成棕黃色。
1.2.3 統計學處理 采用等級資料的秩和檢驗
2 結 果
① 在42℃條件下，加熱不同時間，卵巢癌細胞HO-8910細胞內HSP70的表達見表1。未加熱的細胞內(見圖1A), 有少量的HSP70表達，表現為胞漿內有極淡的淡黃染色；當42℃加溫15 min時，細胞內HSP70的表達與正常細胞相比較無明顯改變；加熱30 min后 (見圖1 ，可見胞漿內HSP70的染色略增強，但顏色仍較淡，僅限于胞漿，但胞漿染色數量增加；無胞核染色；加溫60 min時(見圖1C)，可見胞漿內HSP70的表達增強，表現為胞漿染色加深呈深黃色，染色細胞接近100%，但未見核染色；加溫90 min時(見圖1D)，胞漿內染色進一步加強呈棕黃色，偶爾可見核染色；加溫120 min時(見圖1E)，胞漿內染色表現為明顯的棕黃色，核染色的細胞增多；加溫150 min時(見圖1F)，胞漿內呈深棕黃色，核染色細胞數進一步增多。
表1 HO-8910細胞溫和加熱不同時間的免疫組化染色
組別 例數 染色分級 胞漿染色的細胞數 核染色的細胞數
第一組 10 Ⅰ（淡黃色） 40%～50% 0
第二組 15 Ⅰ（淡黃色） 40%～50% 0
第三組 20 Ⅰ（淡黃色） 80%～90% 0
第四組 20 Ⅱ（深黃色） 100% 0
第五組 20 Ⅲ（棕黃色） 100% 5%
第六組 20 Ⅲ（棕黃色） 100% 10%～15%
第七組 20 Ⅳ（深棕黃色） 100% 20%～30%
※ P<0.05
注：①第一組為未加熱細胞；第二組為42℃加熱15 min；第三組為42℃加熱30 min；第四組為42℃加熱60 min；第五組為42℃加熱90min；第六組為42℃加熱120min；第七組為42℃加熱120min
②免疫組化細胞染色分級標準——淡黃色Ⅰ級；深黃色Ⅱ級；棕黃色Ⅲ級；深棕黃色Ⅳ級
② HO-8910細胞加熱120 min后，間隔不同時間進行免疫組化染色，結果表明, 加熱后1 h，細胞染色呈深棕黃色仍保持強陽性（Ⅳ級），未見明顯淡化；加熱后4 h（見圖2A），在所有染色的細胞爬片中，細胞染色表現為最強Ⅳ級，核染色的細胞約占50%；加熱后6 h，幾乎維持原水平；加熱后12 h，可見胞漿染色有所淡化呈Ⅲ級棕黃色，但核染色未見明顯減少(見圖2 ；加熱后24 h，染色程度呈Ⅲ級，染色細胞數量仍保持100%，但胞核染色明顯減少，(見圖2C)；加熱后48 h，核染色全部消失，胞漿染色明顯變淡呈Ⅱ級深黃色(見圖2D)；72 h后，HSP70的表達進一步減少，細胞染色呈黃色（圖 2E），隨后，細胞染色每隔24 h即有明顯淡化趨勢，120 h后，細胞恢復至正常狀態。
3 討 論
腫瘤熱療學是近20年來迅速發展起來的一門新興學科，為腫瘤患者的治療帶來了一線生機[3]。在臨床應用過程中，發現腫瘤細胞可出現對熱的耐受現象，尤其是當加熱溫度低于43℃（溫和熱療）或加熱時間過長時，更易發生熱耐受[4]。熱耐受不是細胞固有的特性、不遺傳，是一種暫時現象，可能是熱療過程中腫瘤細胞產生的某些物質降低了其對熱的敏感性。研究表明，腫瘤細胞在熱應激發生后，最根本的變化是蛋白質譜的改變，表現為合成了一組特殊的高度保守的蛋白質——HSP或稱為應激蛋白[5]，而正常蛋白質合成卻被抑制。HSP是高熱誘導的一種適應性蛋白，屬于一種分子伴侶，主要功能在于當細胞處于應激狀態時，可糾正新合成蛋白質的折疊和空間構象錯誤，協助轉運蛋白質，抵抗應激原引起的變性，維持生理平衡，從而降低高熱誘導的細胞凋亡[6]。HSP70在HSP家族的眾多成員中,是最出色的熱耐受預測因子[7]。加熱過程中，伴隨HSP70水平的升高，正常蛋白質的合成受到不同程度的抑制。加溫后半小時無蛋白質的合成，隨著HSP70的產生，蛋白質的生物合成逐漸恢復，腫瘤細胞的自我保護機制開始啟動，從而引起腫瘤細胞對熱的敏感性下降。
卵巢癌是威脅女性健康的生殖器三大惡性腫瘤之一，死亡率高，5年生存率不到50%。由于耐藥及抵抗放療效果的腫瘤細胞出現，為卵巢癌的治療帶來了新問題。隨著熱療學理論的日趨成熟，已有研究將其應用于卵巢癌的臨床治療[8]。為了更好的將這一理論應用于臨床，有必要了解卵巢癌細胞對熱療的敏感性。
本實驗結果表明：① 人卵巢癌細胞HO-8910在未加熱狀態下，即有少量的HSP70表達，當給予溫和加熱（即加熱溫度為42℃）時，短時間內，誘導產生的HSP70未見明顯增加。加熱時間≥60 min后，尤其是加熱時間超過120 min后，HSP70的表達明顯增加，表現為隨加熱時間的延長而胞漿的染色加深，而且核染色陽性的細胞數量明顯增多，這一結果表明細胞的熱耐受已啟動。②當細胞受熱120 min后，停止加熱，在最初的幾個小時內（1～4 h），HSP70的表達保持加熱當時的水平，4 h后，HSP70的生成達高峰，表現為染色程度最強，核染色細胞數量最多，說明此時細胞對熱的敏感性最差。如再次加熱，高溫對該細胞的細胞毒作用最低。此后，隨著時間的推移，HSP70的表達明顯減少，5～6 d后恢復至正常水平。從實驗結果還可看出，卵巢癌細胞HO-8910 對HSP70的表達有一定的時間依賴性，這也是臨床上腫瘤熱療間隔需3～4 d的原因之一。此外，雖然可通過提高加熱溫度來減少HSP70的表達，但畢竟39℃～42℃的溫度對于人體來說是能夠承受的溫度，因而，可考慮通過抑制熱療過程中HSP的生成而提高熱療的效率，國外已有相關的文獻報道[9]。
一般而言，腫瘤細胞受熱溫度偏低，時間越長，越易形成熱耐受[10]。人卵巢癌細胞HO-8910細胞在受熱60 min后，就已有明顯的HSP70的表達，而該細胞的恢復過程時間卻長達5～6 d，這就提示我們腫瘤細胞對加熱有一定程度的耐受性，而且熱耐受因細胞不同而有不同的表現[11]，因此，在臨床應用過程中需要考慮到這一要素。