蛋白質譜分析方法特點及其在蛋白組學研究領域中的應用

褚福亮,王福生, 中國人民解放軍第302醫院全軍艾滋病與病毒性肝炎重點實驗室 北京市 100039
項目負責人 王福生, 100039 ,北京市豐臺路26號, 中國人民解放軍第302醫院全軍艾滋病與病毒性肝炎重點實驗室. fswang@public.bta.net.cn
電話:010-66933332 傳真:010-63831870
收稿日期 2002-08-15 接受日期 2002-09-03

摘要
新近廣泛應用蛋白質芯片（ProteinChip^a Array）系統成功鑒定出了一些重要疾病（如腫瘤和危害性較大的傳染病）新的、特異性的生物標記（biomarkers）,后者不僅在生物醫學的基礎方面具有重要的科學價值,而且在臨床疾病的診斷、治療和預防發揮重要的指導作用,顯示了良好的發展前景.本文就表面增強的激光解析電離-飛行時間-質譜（SELDI-TOF-MS）相關的原理、特點、在臨床和基礎研究中的應用新進展和未來的發展趨勢做一綜述.此外,我們就蛋白質譜分析技術在病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝病方面的應用策略和前景進行了分析.

褚福亮,王福生. 蛋白質譜分析方法特點及其在蛋白組學研究領域中的應用.世界華人消化雜志 2002;10(12):1431-1435

0 引言
人類基因組計劃已經進入后基因組時代-即功能基因組時代^[1]，作為基因功能的直接體現者-蛋白質，及其之間的相互作用越來越引起基礎和臨床科學家們的關注^[2-6] .因為要徹底了解生命的本質，只把基因測出來還是不夠的，還必須要了解其在生物生長、發育、衰老和整個生命過程中的功能、不同蛋白質之間的相互作用以及他們與疾病發生、發展和轉化的規律^[7-14] .正因為如此，有關上述問題的蛋白質組學研究成了今天生命科學最重要的焦點之一^[15] .為了闡明蛋白質在上述生命現象中的作用和相關機制，人們設計了許多新的方法技術，如：二維電泳、質譜分析、微距陣列、酵母雙雜交和噬菌體展示等，這些方法在一些特定的情況下，雖然顯示出了他們各自不同的優點，但是同樣也存在著較大的局限性，難以開展大規模、超微量、高通量、全自動篩選蛋白質等方面的分析，因而設計更全面、同時研究多種蛋白質相互作用的技術，在功能基因組和蛋白組學的研究中建立一個更有效的技術平臺，成為本領域中優先關注的問題^[16] .近來，美國Ciphergen（賽弗吉）公司研制的ProteinChip^aArray的儀器，并建立了一種新的蛋白質飛行質譜-表面增強的激光解析離子化-飛行時間-質譜（surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectra， SELDI-TOF-MS），已取得可喜的進展，篩選出了許多與疾病相關的新型生物標志，不僅為臨床疾病的診斷和治療等提供了新的選擇，而且在基礎科學、新藥研制和疾病預防等方面具有廣泛的應用前景^[16-18] .本文就SELDI-TOF-MS相關的原理、特點、在臨床和基礎研究中的應用新進展和未來的發展趨勢做一綜述.

1 ProteinChip^aArray系統和SELDI-TOF-MS的特點
1.1 蛋白質芯片系統的組成和原理 蛋白質芯片系統由三部分組成：蛋白質芯片、芯片閱讀器和芯片軟件.供研究用芯片上有6-10芯池，不同的芯片表面上的化學物質不同，芯片表面分為兩大類：一類為化學類表面，包括經典的色譜分析表面，如：結合普通蛋白質的正相表面，用于反相捕獲的疏水表面，陰陽離子交換表面和捕獲金屬結合蛋白的靜態金屬親合捕獲表面；另一類稱為生物類，特定的蛋白質共價結合于預先活化的表面陣列，可以用來研究傳統的抗體一抗原反應，DNA和蛋白質作用，受體、配體作用和其他的一些分子之間的相互作用^[19] .
   根據檢測目的不同，可以選用不同的芯片，或者自己設計芯片.將樣本和對照點到芯池上以后，經過一段時間的結合反應，用緩沖液或水洗去一些不結合的非特異分子，再加上能量吸收分子（energy absorbing molelule，EAM）溶液，使樣本固定在芯片表面.當溶液干燥后，一個含有分析物和大量能量吸收分子“晶體”就形成了.能量吸收分子對于電離來說非常重要.經過以上步驟，就可經把芯片放到芯片閱讀器中進行質譜分析.
   在閱讀器的固定激光束下，芯片上、下移動，使樣本上每一個特定點都被“讀”到.激光束的每一次閃光釋放的能量都聚集在該區一個非常小的點上（focused laser beam，聚焦激光束）.這樣，每個區都含有豐富的，可尋址（addressable）的位置.蛋白質芯片處理軟件精確控制激光尋讀過程.當樣本受到激發，就開始電離和解除吸附.不同質量的帶電離子在電場中飛行的時間長短不同，計算檢測到的不同時間，就可以得出質量電荷比,把他輸入電腦,形成圖像^[19].Ball et al ^[20]采用一種稱為人工神經網絡（artifical neural network,ANN）的算法處理出現的成千上萬的峰，鑒定出三個分子量為13 454、13 457和14 278的生物標記分子，使疾病預測率達到97.1 %.
1.2 ProteinChip^aArray芯片和SELDI-TOF-MS的特點 新型蛋白芯片與以往的蛋白芯片不同之處：SELDI-TOF-MS，他是在MALDI（matrix-assisted laser desorption/inionation）^［21,22］基礎上，改進后實行表面增強的飛行質譜.SELDI-TOF-MS優于MALDI-TOF表現為他不會破壞蛋白質，或使樣本與可溶的基質共結晶來產生質譜信號.對SELDI-TOF來說，可以直接將血清、尿液、組織抽取物等不需處理直接點樣檢測^[40] ;由于一部分非特異結合的分析物被洗去，因而出現的質峰非常一致，有利于后期分析^[23,24] .
   與二維電泳相比：二維電泳分析蛋白質的分子量在30 KDa以上時電泳圖譜較清楚，對在組織抽提物中占很大比例的低豐度的蛋白質不能被檢出；其次，二維電泳膠上的蛋白質斑點很大一部分包含一種以上的蛋白質；而且，二維電泳耗時長，工作量大，對象染色轉移等技術要求高，不能完全實現自動化.而SELDI-TOF在200 Da-500 KDa區間都可以給出很好的質譜，對一個樣本的分析在幾十分鐘內就可以完成^[19]，處理的信息量遠遠大于二維電泳；對于低豐度物質，即使濃度僅attomole(10-18)的分子，只要與表面探針結合，就可以檢測到，這也是二維電泳所不具備的^[24,25] .
   對于微距陣蛋白芯片來說，需要一種不破壞折疊的蛋白質構象的固定技術，再與另外的蛋白質反應，經檢測瑩光來觀察蛋白質之間的作用^[26] .而基于SELDI-TOF-MS的ProteinChip分析蛋白質不需溶解、不需染色、廉價、針對性強.
   因而蛋白質芯片儀具有以下優勢：(1)可直接使用粗樣本，如：血清、尿液、細胞抽提物等^[27] .(2)使大規模、超微量、高通量、全自動篩選蛋白質成為可能；(3)他不僅可發現一種蛋白質或生物標記分子，而且還可以發現不同的多種方式的組合蛋白質譜，可能與某種疾病有關^[28] ; (4)推動基因組學發展，驗證基因組學方面的變化，基于蛋白質特點發現新的基因.可以推測疾病狀態下，基因啟動何以與正常狀態下不同，受到那些因素的影響，從而跟蹤基因的變化^[2,14,15] .
   其存在的問題：對于不同的樣本，根據檢測的目標采取或者設計幾種芯片，理論上可以把所有的相同性質蛋白質捕獲，但是實際上仍有少量的分子沒與表面探針結合.使用SELDI-TOF-MS，僅能給出蛋白質的分子量，不能給出C端、N端的序列，也沒法知道蛋白質的構型，因此需要將蛋白質充分純化后，用蛋白酶消化芯片上的蛋白質，分析肽段，再用生物信息學方法鑒定蛋白質序列^[18,24] .另外，在國內，該芯片費用較高，分析質譜需要大量后續工作支持.

2 蛋白質芯片在基礎研究方面的應用
Thulasiraman et al,比較鼠疫耶爾森菌(yersinia pestis)的兩種生理狀態下的蛋白質全貌.鼠疫耶爾森菌有兩個中間宿主中：一種為虱類，另一種為噬齒類.鼠疫耶爾森菌可以在兩種溫度下26 ℃和37 ℃表達不同的蛋白質，通過比較兩種生理狀態細胞溶解物，利用靜態金屬吸附捕獲，強化陽離子交換芯片（SAX-2），鑒定出在37 ℃溫度下存在而26 ℃生理狀態下所沒有的分子量為14.9 KDa和78.8 KDa的兩個蛋白質.14.9 KDa的蛋白質被鑒定為抗原-4，78.8 Kda的蛋白質為Catalase/peroxidase KatY蛋白質^[29] .
   Collins et al ^[30] 在體外,用SELDI-TOF證實結核桿菌中上WhiB3編碼蛋白和Rpor編碼蛋白相互作用.他們將WhiB3(his)和帶有369-528氨基酸片段的RpoV基因，在大腸桿菌中過表達純化.然后，分別用疏水表面H4芯片和IMAC-3靜態金屬離子的芯片與其結合.由于WhiB帶有組氨酸作用位點，因而可以與帶Ni²⁺離子的IMAC-3強烈結合，而不與H4芯片結合.帶有396-528氨基酸的GST-RporV則與H4芯片結合.通過反相色譜化結合對照組表明GST-RporV與IMAC-3結合不具有顯著性意義.然后把WhiB3固定在IMAC芯片上，分別用純化的GST-RpoV、GST和伴清蛋白與WhiB3(his)作用.在質譜圖中發現有GST-RpoV，從而證實WhiB3與RpoV之間有相互作用.
   Adilakshmi最近報道，用ProteinChipaarray系統，通過生物素標記的全長度的S25 mRNA作為芯片探針，來證實SELDI-TOF-MS鑒定出在肝瘤細胞處于氨基酸饑餓狀態調節核糖體S25 mRNA的兩種新蛋白質.在對照組中，則不見表達.已往的實驗證實，肝瘤細胞處于饑餓狀態時，則p53蛋白與S25 mRNA結合，在持續饑餓狀態下，S25 mRNA則從核內運輸到胞質中，從而誘導細胞調亡.鑒定出的兩個蛋白質分別La（RNA-binding phosproprotein antigen,RNA結合磷蛋白抗原）43 537 Da和MTF-1（zinc finger metal response element-binding trarscription factor,鋅指金屬反應成分結合轉錄因子）72 830 Da.MTF-1還未見報道，其作用機制還需進一步研究^[31,32] .
   Amaar與其同事發現29 KDa的胰島素樣生長因子結合蛋白質-5(Insulin-like grow binding protein,IGFBP)，是一個重要的骨成形調節因子，其本身也是一種不依賴胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)的生長因子.而IGFBP-5有一段核內定位序列，因而推測他可能可以進入核內，并與核蛋白結合從而影響骨成形基因的轉錄.用IGFBP-5作為誘餌蛋白通過酵母雙雜交觀測與U2人骨肉瘤cDNA文庫反應.結果發現與FHL2有相互作用，FHL2含有4個半LIM結構域.把FHL2固定在蛋白質芯片上，加上IGFBP3-6四個蛋白和對照組作用一段時間后，用緩沖液洗去.通過SELDI-TOF-MS分析,發現只有IGFBP-5組中出現一個質量28 732.6+H的峰，而其他組則沒有出現.證實IGFBP-5確實和FHL2作用從而調節骨的形成^[33] .

3 蛋白質芯片在臨床方面的應用
Christophe et al最近用含有銅離子的IMAC-3芯片鑒定出一個約16 570 Da的蛋白質.該蛋白質在胰腺癌患者的胰液中檢出率為67 %，在其他類胰臟病中的檢出率為17 %.用ProteinChip免疫鑒定該蛋白質是從急性胰腺炎和肝細胞癌患者的胰泡中釋放出的一種稱為HIP/PAP-I（hepatocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis-associated-protein I）的蛋白質.HIP/PAP-I水平在胰腺癌患者的胰液和血清中含量與對照組相比，二者都具有極顯著性意義.但是，胰腺癌患者胰液中的HIP/PAP-I水平比血清中的大1 000倍，與對照組相比，胰液中HIP/PAP-I的含量［患者組(143.75±235.52) mg/ml,對照組(6.04±7.59) mg/ml］遠大于血清中的含量［患者組(99.96±140.66) ng/ml,對照組(35.25±28.44) ng/ml］.由此，可以根據患者胰液中HIP/PAP-I的含量來幫助鑒定是否患上致死率很高的胰腺癌[34] .
   Wright et al通過研究前列腺患者的組織提取液，尋找已知的前列腺特異抗原（PSA），前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphotase)，前列腺特異膜抗原（PMSA）和前列腺特異肽.所使用的方法：從使用LCM(laser capture microdissection)方法獲得的前列腺患者的細胞和體液中,發現了前列腺癌中上調兩個分別為33 KDa和18 KDa的蛋白質^[35-49] .盡管沒有發現單一蛋白質來區別前列腺癌患者和對照組,但卻發現一組蛋白質的峰值與健康老年男性群體不同.而有報道發現一個50.8 KDa的蛋白質存在于所檢查的全部患者的血清和尿液中.這可能是50.8 KDa蛋白質是由33 KDa和18 KDa的兩個亞基構成的蛋白質,或者是兩個單獨的蛋白質由于芯片上的探針同時捕獲了這兩個蛋白質，這還需要進一步研究證實^[29,35] .
   有人發現了在乳腺癌細胞中存在28.3 KDa特異蛋白質，由此設計出NMP66試劑盒，用其對可疑患者進行檢測，結果在乳腺癌早期診斷中及晚期轉移性乳腺癌的診斷上特異性達到100 %,在排除非惡性腫瘤個體的特異性達到96 %，遠高于當前臨床上目前應用的檢測手段^[50-52]