(一)制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞
下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制備的大腸桿菌DHl、DH5和ＭＭ249感受態細胞培養物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108轉化菌落的頻率進行轉化，其他大多數大腸桿菌菌株的最高轉化率大約只有前述菌株的1/10-1/5。盡管如此，實際上對所有克隆方面的用途來說，這已綽綽有余。一些大腸桿菌菌株（如ＭＣ1061）不適于此法。下列有３個因素對于獲得持續高的轉化頻率來說是至關重要的：
（１）轉化緩沖液中試劑的純度 務必使用所能得到的最高質量的試劑，這些試劑應分裝成小份，避光保存于冷處。
（２）細胞的生長狀態 由于一些不清楚的原因，直接用貯存于-70┴冰凍培養基中的貯存原種搠種而進持培養的細菌，所得到的轉化效率最高，不應使用在實驗中的貯存原咱接種崦進持培養的細菌，所得到的轉效率最高，不應使用在實驗室中連續傳代，貯存于４℃或貯存于室溫的培養物。
（３）玻璃和塑料器皿的清潔度 痕量的去污劑或其他化學物質的存在可能大大地降低細菌的論效率，所以最好撥出一批玻璃器皿專用于制備感受態細菌，而不作它用。這些玻璃器皿應用手洗刷，再灌滿純水（Ｍilli-Ｑ級或與其相當的級別），然后高壓滅菌，臨用前方把水倒掉。細心操作的話，幾乎總是可以獲得轉化效率高的感受態細胞，每微克超螺旋ＤＮＡ可能得到5x107-1x108個轉化菌落。然而甚至經驗最為豐富的工作者也不可能保證持有必要用標準的螺旋質粒ＤＮＡ制品來檢測每一批新的感受態細胞的轉化效率。制備感受態細胞前，先制備一大批黧的螺旋質粒ＤＮＡ，分裝成許多小份貯存于-70℃。這些標準制品可用來檢驗每一批新的感受態細胞的轉化效率，并檢查每一個實驗的轉化效率。設立這樣一個陽性對照后，如果某一次實驗得不到轉化菌落，就可以根據對照的情況查明宣究竟是感受態細菌方面有庇漏，還是ＤＮＡ制品間有差異。分裝的感受態細菌可在-70℃保存幾個月而轉效率無明顯下降。１）用無菌鉑絲直接蘸取凍存有大腸桿菌ＤＨl株（或ＤＨ５株、ＭＭ249株原種）（貯存于-70℃的凍培養基上，見附錄Ａ），在SOB瓊脂平板表面劃線， 于37℃培養16小時。將冰凍的細菌融化，鉑絲在凍存細菌原種的表面劃過時，已帶上足量的細菌，因此一管凍存細菌原種可使用多次。
２）將４－５個分隔良好的菌落轉移到１ml含20mmol/L MgSo４的SOB中，菌落直徑為１－２mm。中速振蕩使細菌分散，然后在1L錐瓶中用30-100ml含20mmol/LMgSO4的SOB稀釋培養物。
３）于37℃將細菌培養0.5-3.0小時，為達到高效轉化，活細胞數務必少于108細胞/ml，可每隔20-30分鐘測定ＯＤ600值來檢測培養物的生長情況。在菌株與菌株之間，ＯＤ600值和每毫升中活細胞數間的關系變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長培養物在生長周期的不同時相的ＯＤ600值，并將各稀釋度的培養物鋪于無抗生素的ＬＢ瓊脂平皿以計算每時相的活細胞數，從而使分光光度讀數得到標化。
４）在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至０℃。
切記：下述所有步驟均需無菌操作。
５）于４℃用Sorvall GS3轉頭（或與其相當的轉頭）以4000轉/分離心10分鐘， 回收細胞。
６）倒出培養液，將管倒置１分鐘以使最后殘留的痕量培養液流盡。
７）用約20ml（每個50ml管）用冰預冷的轉化緩沖液（對于TFB,見表1.3；對于FSB，可參見表1，4）輕輕振蕩，重懸沉淀（若制備需立即使用的感受態細胞可用TFB:若制備需要貯存于－70℃的感受態細胞則用FSB），將重懸細胞冰浴10分鐘。
８）于４℃用Sorvall GS3轉頭或與其相當的轉頭）以4000轉．分離心10分鐘，回收細胞。
９）倒出培養液，將管倒置１分鐘以使最后殘留的痕量培養液流盡。
10）用４ml（每個50ml管）用冰預冷的ＴＦＢ或ＦＳＢ輕輕振蕩重懸沉淀。
按步驟11）a給出的操作程序制備立即使用的感受態細胞，而步驟11）b制德貯存于-70℃留待以后使用的感受態細胞。
11）a.新鮮感受態細胞的制備
a）將140μl DnD溶液加到每一懸液的中心，立即輕輕旋轉以混勻懸液，然后在冰上放置15分鐘。
DnD溶液
二硫蘇糖醇（DTT) 1.53g
DMSO 9.0ML
1mol/L乙酸鉀（pH78.5) 100μl
水至 10ML
DnD溶液作可耐受人機溶劑的Millex SR膜（Millipore）過濾除菌，將DnD溶液分裝成160μl小份放入0.5ml的無菌微量離心管中，密封管口，貯存于-20℃。
DMSO的氧化產物，據推測可能是二甲硫醚，是轉化的掏物。為避免這個問題，應購買質量最好的DMSO。應將所購試劑分裝成10ml小份，放入無菌試管，密封管口，貯存于-70℃。每小份只用１次，用后棄去。１mol/L乙酸鉀（pH7.5）的配法。
b）每管再加140μlDnD溶液，輕輕旋轉混勻之，將懸液置于冰上，再放15分鐘。
c）將小份懸液分裝到冷卻的無菌聚丙烯管（Falcon 2059,17x100mm）中，將管置于冰上。就大多數克隆方面的用途來說，50μl感受細胞懸液已綽綽有余。然而，如需要更大量的轉化菌落（如構建cDNA文庫），每小份感受態細胞的量可能需要加大些．加入ＤＮＡ后[步驟12)]，于42℃短暫加熱感受態細胞[步驟13)]，這是一個關鍵步驟，務必以正確的升溫速度使細胞加溫到正確的溫度。下面給出的所有時間和溫度是用Falcon 2059型管獲得的數據，其他類型的管未必可產生相同的結果。
b.凍存的感受態細胞的制備
a）每４ml重懸細胞加140 μl DMSO，輕輕旋轉混勻之，將懸液置冰上15分鐘。
b）每份懸液再加140μl DMSO，輕輕旋轉混勻之，重新放入冰浴中。
c）迅速將懸液分裝到冷卻的無菌的微時離心管中，封緊管口，沒入液氮中快速冰凍感受態細胞。貯存于-70℃備用。就大多數克隆方面的用途來說，50μl感受態細胞懸液已綽綽有余。然而，如需要更大量的轉化菌落（如構建cDNA文庫），每小份感受態細胞的量可能需要加大些。
d）需要時，從-70℃冰箱中取出一管感受態細胞，把管握于手民主，融化細胞。細胞一經融化，立即把管轉移至冰浴中，在冰上放置10分鐘。
e）用一冷卻的無菌吸頭把感受態細胞轉移到冷卻的無菌聚丙烯管中（Falcon2059,17x100mm）中，放置在冰浴上。加入ＤＮＡ后[步驟12)]，于42℃短暫加熱感受態細胞[步驟３)]，這是一個關鏈步驟，務必以正確的升溫速度使細胞如溫到正確的溫度。下面給出的所有時間和溫度是用Falcon 2059試管獲者的數據，其他類型的管未必可產生相同的結果。
12）將ＤＮＡ加入到感受態細胞中，輕輕旋轉幾認混勻內容物。在冰上放置30分鐘。為得到最佳結果，ＤＮＡ溶液的體積不應超過感受態細胞體積的５％。轉化體的數量相對于所加入的ＤＮＡ量近妣例地增加，直至系統達到飽和，盡管感受態細胞在不同批次之間有一些差異，50μl感受態細胞通常可被約lng超粒ＤＮＡ所飽和。雖然再加ＤＮＡ也不影響轉化體的總產量，但使用過多的ＤＮＡ將降低系統的效率（以每微克ＤＮＡ所獲轉化體的數量來衡量）。當所轉化的ＤＮＡ很難得時（如用從相對難得的樣品中提取mRNA而合成的cDNA），這就顯得格外重要。為最大限度地提高轉化菌落的數目，可把現有ＤＮＡ分置于幾小份感受態細胞中，以期系統不致飽和。試驗中一定包括下面的對照：
a.加入已知量的標準超螺旋質粒ＤＮＡ制品的感受態細胞。
b.完全不加質粒ＤＮＡ的感受態細菌。
13）將管放入預加溫到42℃的循環水浴中放好的試管加架上，恰恰放置90秒，不要搖動試管。
14）快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻１－２分鐘。
15）每管加800μl ＳＯＣ培養基（見附錄Ａ）。用水浴將培養基加溫至37℃，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育43分釧使細菌復蘇并表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。為最大限度地提高轉化效率，復蘇期中應溫放地搖動細胞（轉速225轉/分）。
16）將適當體積（每個90m平板達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/L MgSO4和相應抗生素的ＳＯＢ瓊脂培養基上。如培養物體積太小（〈10μl），可再加肉湯培養基，用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉化的細胞涂到瓊脂平表面。如在一個90mm平板上鋪200μl以上的感受態細胞，應離心濃縮細胞（于室溫用Sorvall SS34轉頭（或與其相當的轉頭）以4000轉/分離心10分鐘），然后用適量SOC輕輕重懸細胞。如用四環素抗性作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個單獨的平皿上（或鋪在軟瓊脂中）。然而如選用氨芐青霉素抗性，則只能將一部分培養物（根據實驗決定）鋪在單獨的平皿上，氨芐青霉素抗性菌落數的曾加與平皿上所加細菌數的增加并無線性比例關系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長抑制物質的緣故。\par 17）將平板置于室溫直至液體被吸收。
18）倒置平皿，于37℃培養，12-16小時后可出現菌落。如檢查氨芐青霉素抗性，用轉化細胞鋪平板時密度應較低（每個90mm平板不超過104菌落），于37℃培養平板時不應超過20小時。氨芐青霉素抗性的轉化體可將β－內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域中的抗生素。這樣，鋪平板時懊度太高或培養時間太長都會導致出現對氨芐青霉敏感的衛星菌落。在造反增減基中不用氨芐青霉素而改用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。
（二）用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態細胞
下面的簡單方案是Clhen等（1972）所用方法的變通方案，常用于成批制備感受態細菌，這些細菌可使每微克螺旋質粒ＤＮＡ產生5x106-2x107個轉化菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規克隆的需要。該方法完全適用于大多數大腸桿菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重復性更好。該法制備的感受態細胞可貯存于-70℃，但保存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響。
１）從于37℃培養16-20小時的新鮮平板中挑取一個單菌落（直徑２－３mm），轉到一個含有100ml LB或SOB培養基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養約３小時（旋轉搖床，300轉/分）。為得到有效轉化，活細胞數不應超過108細胞ml，可每隔20-30分種測量OD600值來監測培養物的生長情況。在菌株與菌株之間，ＯＤ600值和每毫升中活細胞數間的關系變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長增減物在生長周期的不同時相的ＯＤ600值，并將各黧度的增減物鋪于無抗生素的ＬＢ瓊脂平皿以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度讀數得到標化。
２）在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至０℃。切記：下述所有步驟均需無菌操作。
３）于４℃用Sorvall GS3轉頭（或與其相當的轉頭）以4000轉/分離心10分鐘，以回收細胞。
４）倒出培養液，將管倒置１分釧以使最后殘留的痕量培養液流盡。
５）以10ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。我們發現將１mol/L CaCl2貯存液[用純水（Ｍille-Q級或與其相當的級別）配制]以10ml小份貯存于-20℃煞是方便。制備感受態細胞時，取一小份融化，用純水稀釋至100mlk，用Nalgene濾器（0.45μm孔徑）過濾除菌，然后驟冷到０℃即可。 對于大多數大腸肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在這一步采用TFB（見表1.3）代替氯化鈣可得到相同的或更好的結果。
６）于４℃以4000轉/分離心10分鐘，以回收細胞。
７）倒出培養液，將管倒置１分鐘以使最后殘留的痕量培養液流盡。
８）每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2[或ＴＦＢ，見表1.3和步驟５）注]重懸每份細胞沉淀。此時，可將細胞分成小份，放于-70℃凍存.在這些條件下，盡管長期保存后轉化效率會稍有下降，但細胞仍可保持處于感受態。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明細胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小時，在貯存的最初12-24小時內，轉化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。
９）用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加ＤＮＡ（體積∞10μl,ＤＮＡ∞50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘。
10）將管放到預加溫到42℃的循環水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動試管。
11）快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻１－２分鐘。
12）每管加800μlＳＯＣ培養基（見附錄Ａ）。用水溶將培養基加溫至37℃，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育45分鐘細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。如果要求更高的轉化效率，在復蘇期中，應溫和地搖動細胞（轉速不超過225轉/分）。
13）將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/L MgSO4和相應抗生素的ＳＯＢ瓊脂培養基上。如培養物體積太小（〈10μl）。可再加肉湯培養基，用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉化的細胞涂到瓊脂平板表面。 如在一個90mm平板上鋪200μl以上的感受態細胞，應離心濃縮細胞，然后用適量ＳＯＣ輕輕重懸細胞。如用四環素抗性作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個單獨的平皿上（或鋪在軟瓊脂中）。然而如選用氨芐青霉素抗性，則只能將一部分培養物（根據實驗決定）鋪在單獨的平皿上。氨芐青霉素抗性功的增加與平皿上所加細菌數的增加并無線性比例關系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長掏物質的緣故。
14）將平板置于室溫直至液體被吸收。
15）倒置平皿，于37℃培養，12-16小時后可出現菌落。如檢查氨芐青霉素抗性，用轉化細胞鋪增板時密度較低（每個90mm平板不超過104菌落），于37℃培養平板時不應超過20小時。氨芐青霉素抗性的轉化可將β－內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域中的抗生素。這樣，鋪平板時密度太高或培養時間太長都會導致出現對氨芐青霉素敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨芐青霉素而改用羧芐青霉素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底根除之。