［摘 要］ 目的：了解無錫地區HBV前C／C基因變異情況,探討基因變異對乙肝病毒標志物(HBVM)及HBV DNA定量的影響。方法： HBVM用時間分辨熒光定量試劑檢測;HBV DNA定量PCR以德國Roche Lightcycler 熒光定量擴增儀檢測;HBV DNA前C／C測序使用①德國Roche Mag NA Pure LC 全自動核酸提取，加樣系統;②美國Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System。結果： 92例乙肝患者血清中有41例(44 6％)發生前C／C區nt1896位變異,41例中有34例HbeAg陰性,7例HbeAg仍為陽性;以nt1896位是否變異分組,變異組和未變異組HBV DNA定量無顯著性差異。結論： nt1896位變異導致HBeAg轉陰,HBV病毒變異對HBVM有決定性的影響,但該變異對HBV復制無影響。
HBV感染在臨床可產生不同的肝臟疾病譜,過去多以HBV免疫學標志物來判斷病毒感染狀況［1］。但隨著分子生物學技術的發展,研究發現肝臟疾病譜不僅與宿主的免疫有關,也與病毒本身密切相關,即HBV 本身也存在變異。對HBV變異的判斷,最可靠和精確的方法是從病人體內檢出HBV DNA,用DNA測序法來確定病毒的變異,目前對于HBV的變異的研究比較集中在關于前C區及S基因區的變異。本文結合92例乙肝患者的PCR定量、免疫學標志物定量結果以及DNA前C／C區測序結果報道如下。
1 材料與方法
1 1 分析對象
本組92例為無錫地區2004年1月~10月在無錫市傳染病醫院門診及住院的乙肝患者,均為HBVDNA陽性病人。
1 2 檢測方法
1 2 1 乙肝病毒標志HBsAg、抗 HBs、HBeAg、抗 Hbe和抗 HBc以美國PE1235automatic immunoassay system 檢測,試劑為上海新波產的兩對半時間分辨熒光定量試劑。
1 2 2 定量聚合酶聯反應(PCR)HBV DNA定量PCR 以德國Roche Lightcycler熒光定量擴增儀檢測,試劑為深圳匹基產HBV DNA熒光定量試劑。
1 2 3 HBV DNA前C／C區測序 使用①德國Roche MagNA Pure LC全自動核酸提取、加樣系統,獲得HBV DNA模板;②在美國PE 9600擴增儀擴增:94℃預變性3 min,94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 30 s,循環35次;③用Promega公司的PCR產物純化試劑盒純化PCR產物;④純化產物用Beckman測序試劑盒進行測序反應:96℃ 20 s,55℃ 20 s,60℃4 min,循環30次,終止測序反應,然后在美國Beckman Coulter CEQ8000 Genetic Analysis System上得到HBV DNA 的序列和圖譜。所測HBV DNA序列的堿基位置:nt1737 2483,所測長度:746 bp,上游引物序列及位置:5’ GAGTTGGGGGAGATTAG 3’(1737 1756),下游引物序列及位置:5’ AAAGTTTCCCACCTTATGAGTC 3’(2483 2462);引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。
1 2 4 統計學處理 采用t檢驗和χ2檢驗。
2 結 果( 略)
3 討 論
表1中HBV DNA 1827位ntc→a突變達88％, 表2 HBVM與1896位變異表3 1896位變異與e抗原相關性表4 病毒與DNA定量相關性基本體現無錫地區HBV DNA單核苷酸多態性突變水平,意義目前不詳。1896位ntg→a突變達44 6％(41／92),據國外報道,這種變異大多發生在亞洲東部及南歐地區,發生率可以高達47％～60％,而在美國只有10％左右,胡耀仁等［2］報道寧波乙肝患者1896位變異率為42 58％,本文結果與報道相近。由于1896位ntc→a突變(鳥嘌呤→腺嘌呤),使原來編碼色氨酸的前C區第28個密碼子(TGG)轉變為翻譯終止密碼子(TAG),因而前C蛋白的翻譯中斷,HBeAg不能產生,檢測會出現陰性結果,從表3中可見,與變異有關HBeAg轉陰有34例,從而證實1896位變異與HBeAg轉陰具有密切相關性。2005位ntt→a突變和2074位ntt→c突變因為是密碼子的第三堿基發生突變,翻譯的氨基酸仍是原來的氨基酸,屬同義突變。
圖譜分析是測序儀利用4種熒光染料分別標記終止物ddNTP,通過電泳將各個熒光標記片段分開,經激光掃描,光柵分光,區分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光,在 CCD攝影機上同步成像。圖1顯示1896位正常為G,圖2顯示1896位發生突變為A。
從表3可以看出(由表2中統計而來),1896位變異組共有41例,其中34例e抗原陰性,說明與1896位變異有密切關系(P<0 005);有7例e抗原仍為陽性,可能與體內仍存在野生株復制的情況有關。在51例1896位未變異一組,其中13例e抗原陰性,而HBV DNA定量顯示有病毒的復制,與理論結果不符,原因可能與其他位點變異有關。
從表4中可以看出以nt1896位變異分組,兩組病毒DNA定量無顯著性差異(P>0 05),說明1896位變異會導致HBeAg不能產生,檢查陰性結果,但不能反映HBV復制減輕和消失,而仍有HBV前C區變異病毒的存在和復制,結論與文獻相符［3］。
李伯安等［4］認為單獨的血清學標志檢測不能反映肝臟的病變程度,也不能良好反映病毒的復制。
臨床上對不同肝臟疾病譜的認識,有必要結合二對半結果和PCR DNA定量以及基因測序結果,才會對乙肝病毒的感染狀況有一個比較準確的判斷,才能對癥治療,取得較好的治療效果。由于前C／C區1896位的變異,導致HBeAg轉陰,不能就此而否定病毒的復制。
測序結果表明,HBV病毒基因變異對HBVM結果產生根本性的影響,它們是基因型和表現型的關系,即基因型決定表現型,但病毒復制繼續進行。
