眾多流行病學、遺傳學與臨床研究證實，血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平與動脈粥樣硬化(AS)、冠心病(CHD)的發生率呈正相關，通常以高LDL-C作為CHD的首要致病因素。美國國家膽固醇教育計劃(NCEP)成人治療專業組規定以LDL-C水平作為高脂血癥的分類與治療基礎及需要達到的治療目標。作者參考新近有關文獻，對LDL-C的檢測方法及標準化問題作一簡述。
一、LDL的生物化學
LDL是一組不均一的富含膽固醇的脂蛋白顆粒，漂浮密度(d)為1.006～1.063 kg/L。LDL中膽固醇酯(CE)、磷脂(PL)、蛋白質(Pro)、甘油三酯(TG)和未酯化膽固醇含量分別約為38%、22%、21%、11%和8%。應用非變性梯度凝膠電泳法或密度梯度超離心法可將LDL分為3種或更多亞組分，其名稱也因實驗方法而異。在LDL亞組分中有一部分LDL的顆粒較小(直徑＜26 nm)，密度較大(1.04～1.06 kg/L)，稱為小而密LDL(small，dense LDL)，亦稱B型LDL；一部分LDL的顆粒較大(直徑＞27 nm)，密度較小(1.02～1.03 kg/L)，稱為大而輕LDL(large，buoyant LDL)，亦稱A型LDL；介于兩者之間的亞組分稱中間型LDL［1］。近年小而密LDL與CHD的關系越來越受到重視，小而密LDL升高，或在整個LDL中所占比例升高與致AS的脂蛋白表型之間有著密切關系，這種脂蛋白表型常有HDL水平低和高TG血癥的特征。
二、LDL-C的測定方法
測定血清LDL-C通常需根據各種脂蛋白密度、顆粒大小、電荷或apoB含量等，應用超速離心法、色譜法、電泳法、化學或免疫沉淀法將LDL與其他脂蛋白分離開，然后測定LDL組分中膽固醇含量。公式計算法在臨床與科研中應用較廣，近年相繼報道一些均相測定法已引起人們極大興趣與廣泛關注。
1.超速離心法：美國疾病預防與控制中心(CDC)測定LDL-C的參考方法為超速離心法(Beta- quantification，β-定量法)，也為NCEP所推薦［2，3］。方法基本同HDL-C測定。即用超速離心法除去VLDL組分(d＜1.006 kg/L)后，測定d＞1.006 kg/L組分的總膽固醇(Chol)含量，減去HDL-C。計算方法：［LDL-C］=［d＞1.006 kg/L Chol］-［HDL-C］。此法測定的LDL-C，實際上包括脂蛋白(a)［Lp(a)］和中間密度脂蛋白(IDL)的膽固醇含量，也是評價其他檢測方法準確性的基礎。目前尚沒有真正意義的測定LDL-C的參考方法。β-定量法需昂貴的設備、操作復雜、費時且技術要求高，不易在普通實驗室開展。
2.Friedewald公式計算法：此法是目前應用較廣的估測LDL-C的方法，其以VLDL組成恒定(VLDL-C/TG=0.2，均以mg/dl計）的假設為前提，具有簡便、直接、快速等優點。計算公式為：(1)LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2(以mmol/L計)。(2)LDL-C=TC-HDL-C-TG/5(以mg/dl計)。應用此公式計算LDL-C常受TC、TG和HDL-C變異的影響。Friedewald公式法計算LDL-C的總變異達9.5%，故需要TC、TG和HDL-C測定結果準確且符合標準化的要求［2］。如某項測定值誤差較大，則會導致計算結果不可靠，因而使其臨床應用受到更多挑戰與限制。下列情況不宜采用Friedewald公式法計算：(1)血清中存在CM。(2)血清TG＞4.52 mmol/L(400 mg/dl)時。(3)血清中存在異常β脂蛋白時［Ⅲ型高脂血癥(HLP)］［3］。近來Planella等［4］報道一種根據apoB、TC和TG估算LDL-C的新公式，其不受高TG血癥影響，可準確用于非乳糜微粒血癥的分類。Planella公式為：LDL-C=0.41 TC-0.32TG+1.70 apoB-0.27(TC、TG以mmol/L計，apoB以g/L計)。此法測定LDL-C的不精密度為1.45%，低于Friedewald公式法(2.97%)，與β-定量法結果明顯相關。應用此法將非乳糜微粒引起的高脂血癥進行分類，其與β-定量法分類的平均符合率為96.8%，亦高于Friedewald公式法(93.0%)。該公式法不受高TG的影響，在一些方面更優于Friedewald公式法。但此法易受apoB測定結果的影響，需對其測定進行標準化。
3.化學沉淀法：常用方法為肝素-枸櫞酸鈉法、聚乙烯硫酸沉淀法(PVS法)和多環表面活化陰離子法等。血清中LDL經選擇性沉淀后，測定上清液中的Chol代表HDL-C與VLDL-C之和，用TC減去上清液Chol即得LDL-C值。因PVS法為非離子反應，實驗條件要求不高，在pH 3～8范圍內均可完全沉淀且PVS不干擾酶法測定Chol，故目前商品試劑多采用PVS法。中華醫學會檢驗學會在國內推薦PVS法作為LDL-C測定的常規方法［5］。本法沉淀物中也包含IDL和Lp(a)。Lp(a)與LDL的化學組成、物理性質和免疫原性極為相似，Lp(a)含膽固醇約30%，在Lp(a)增高時，可從LDL-C測定值中減去Lp(a)×0.3(以mg/L計)。特別是在低LDL-C水平時，最好同時測定LDL-C與Lp(a)，否則可能掩蓋高Lp(a)的存在，也便于校正LDL-C值及比較兩項指標在冠心病危險因素估計作用中的大小［6］。但目前亦存在一些爭議。這類方法主要缺點是TG水平較高(＞4.52 mmol/L)時，有時因LDL沉淀不完全而使結果偏低。Reference Diagnostics公司近來推出一種簡便可靠的磁性分離法測定LDL-C的試劑盒，其原理是血清與磁性分離劑混合后37°C孵育10分鐘，然后將分離管放在磁性物表面，LDL顆粒在多聚陰離子作用下因被磁化而很快被去除。用TC減去上清液中非LDL-C含量即為LDL-C值［7］。此方法簡單迅速，結果準確，精密度高(批內、批間CV均＜2.5%)，與Friedewald公式法相關性好(r=0.942)，與β-定量法結果一致。此法不受高TG干擾，有一定應用價值。
4.免疫分離法(Immunoseparation Method)：由Leary等［8］于1993年首先報道，Genzyme Diagnostics建立的一種相當簡便直接測定LDL-C的方法。目前Sigma及其他一些公司已有可供臨床應用的商品試劑盒。先將200 μl用PEG和結合有抗人apoE、apoAⅠ多克隆抗體的膠乳珠分離試劑與30 μl血清標本同時加到專用分離管的內管(含200 nm濾膜)中，混勻后置室溫5～10分鐘，讓血清中HDL(含apoAⅠ/E)、IDL(含apoE)、VLDL(含apoE)及CM(含apoAⅠ/E)與分離試劑中的抗體反應結合；然后以1 200～12 000×g(一般為2 200×g)速度離心沉淀5分鐘；置室溫平衡后，取出并棄去內管；用酶法測定分離管外管中濾液膽固醇含量，即可確定血清LDL-C水平。國外已有許多作者對此法進行了系統評價［2，8～10］。多認為此法精密度好(批內、批間CV＜3%)，準確度高，特別是對于低LDL-C濃度的測定結果準確。與β-定量法有較好相關性，不受高TG水平的影響，可用于禁食或非禁食標本的檢測。缺點是需專用分離管，試劑成本較高，難以自動化。且不適于冰凍或凍干標本的測定，如用冰凍標本LDL-C值會下降達25%，用凍干標本可產生50%～75%的負偏差。Levinson等［11］認為免疫分離法應用范圍相當有限，對于空腹血清TG＜4.52 mmol/L的患者和TG在1.70～2.83 mmol/L的多數患者，用Friedewald公式法估算LDL-C似乎更好。免疫分離法可用于TG＞4.52 mmol/L的少數患者LDL-C的檢測，對于極少的Ⅲ型HLP患者LDL-C的測定亦有一定應用價值。
5.均相測定法(Homogeneous assay)：由于化學沉淀法和免疫分離法測定LDL-C均需要進行樣本預處理，其最大缺點是不能進行自動化分析，不適應大規模流行病學調查或臨床大批量標本諸多項目同時檢測。國外近兩年相繼研制開發出幾種不同類型的均相測定法，標本不需沉淀處理，可用于自動生化分析儀自動測定。(1)選擇性反應法［12～14］：基于用表面活性劑控制酶與相應脂蛋白的反應的新技術研制而成，多為液體雙試劑。目前有兩類檢測系統：第一類系統的試劑1中的表面活性劑 1可使血清樣品中的HDL、CM和VLDL顆粒解離，Chol分子被釋放出來，與膽固醇酶試劑反應，產生的H2O2在缺乏偶聯劑時被消耗而不顯色，此時LDL顆粒仍是完整的。加試劑2(含表面活性劑2和偶聯劑DSBmT)，它可使LDL顆粒解離釋放Chol，參與Trinder反應而顯色，因其他脂蛋白的Chol分子已除去，色澤深淺與LDL-C量呈比例［12，13］。日本第一化學藥品株式會社(Daiichi)的DA-6101、Genzyme Diagnostics公司的N-genousTM LDL-C試劑盒均屬此類方法。此法所需標本量少(3 μl血清)，精密度高(批內、批間CV＜2.5%)，線性范圍可達4.52 mmol/L，回收率90%～110%，與β-定量法及免疫分離法相關性均好(r=0.958～0.992)，基本不受VitC、膽紅素、血紅蛋白及γ球蛋白等影響。TC、TG分別高至14.7 mmol/L，20.5 mmol/L時，對LDL-C測定無明顯影響。第二類系統的試劑1含α-環糊精硫酸鹽、硫酸葡聚糖(DS 500)、MgCl2、EMSE和MOPS，試劑2中含CHER、CHOD、過氧化物酶、4-AA、POE-POP和MOPS。α-環糊精硫酸鹽在少量DS及Mg2+存在下，可減少CM和VLDL組分中的膽固醇與酶試劑的反應。多聚物聚氧化乙烯-聚氧化丙烯封閉共聚多醚(POE-POP)可減少HDL組分膽固醇的反應。兩者結合則可選擇性的測定LDL-C［14］。此法在TG為0.3～22.6 mmol/L范圍內與β-定量法具有較好的相關性，檢測線性可達15.5 mmol/L，最小檢測濃度為0.005 mmol/L，回收率為97%～105%，除當結合膽紅素、枸櫞酸鹽的終濃度分別高至0.68與12.9 mmol/L時，可使LDL-C測定結果分別降低10%或7.8%外，基本不受其他物質的干擾。(2)透射比濁法［15］：Boehringer Mannheim公司基于多聚陰離子試劑PAMPS與LDL顆粒發生特殊凝集反應設計而成。試劑1中的兩性離子表面活性劑可使樣品中HDL、CM和VLDL(富含TG)顆粒遮蔽。加試劑2［含觸須狀多聚陰離子(PAMPS)和兩性離子表面活性劑］，在Mg2+存在下，LDL顆粒與PAMPS作用形成LDL-觸須狀多聚陰離子復合物，所產生濁度與LDL-C含量成比例。此法與β-定量法相關性好(r=0.97)，批間CV為0.9%～5.7%(LDL-C在1.25～8.40 mmol/L之間)，標本在1.3～10.4 mmol/L范圍內不需預稀釋，實驗室間可比性平均CV為4.7%，不受黃疸、溶血干擾，TG＞4.52 mmol/L也不影響測定結果，亦不受肝素等31種治療藥物的干擾。但此法在Technicon系列等自動生化分析儀上的應用受到一定限制。(3)PEG修飾法：基于PEG修飾酶(CHER/PEG，CHOD/PEG)對不同脂蛋白膽固醇反應的選擇性結合表面活性劑的作用設計而成。首先試劑1中多聚陰離子和表面活性劑封閉血清中LDL顆粒，讓HDL、VLDL、CM顆粒解離，釋放出Chol與酶試劑反應，產生的H2O2在缺乏偶聯劑時被消耗而不顯色。加入試劑2后，LDL-C參與顯色反應，色澤深淺與LDL-C量呈比例。日本協和(Kyowa)公司已研制出商品試劑盒供臨床應用。但目前尚乏見有關此法的評價報告。
6.電泳法：在一定電場條件下，由于各種脂蛋白的顆粒大小及其在緩沖溶液中所帶電荷數的不同，故在支持介質(如瓊脂糖凝膠)上遷移率亦不同。較小的HDL顆粒向陽極有較高的遷移率，再依次為Lp(a)、VLDL與LDL，LDL緊靠陰極端，膽固醇染色后即可確定各種脂蛋白膽固醇的百分率。結合血清TC值，即可確定LDL-C值［16］。Helena公司已有可供REP電泳儀使用的檢測LDL-C的試劑盒，并可同時檢測VLDL-C、HDL-C和Lp(a)-C，可用于高脂血癥的診斷與分型。此法測定的是單純LDL-C，不包含Lp(a)中的膽固醇，特別適合TG＞4.52 mmol/L的標本LDL-C的測定。對每種脂蛋白帶膽固醇的線性至10.4 mmol/L，分析敏感性0.065 mmol/L。測定LDL-C批內CV為1.3%～2.7%，批間CV為3.7%，與β-定量法有良好的相關性(r=0.998)，總體偏差約6.0%。電泳法測定LDL-C總誤差約為13.3%，略高于NCEP推薦的12.0%。
三、LDL-C檢測的標準化
LDL-C是血脂分析的常規項目，高LDL-C與臨床心血管病事件發生率密切相關。由于目前國內外尚缺乏LDL-C測定的正式標準化方案，使得其標準化工作更為困難。LDL-C檢測的標準化主要在于標準化方案的制定與實施、標準物質和質控材料的制備及方法的合理選擇與測定標準化。
1.標準化目標：LDL-C測定的變異主要來源于生理變異(CVb)和分析變異(CVa)，研究表明LDL-C的CVb為6%～11%(平均8.2%)，CVa為3%～7%(平均4%)。NCEP對LDL-C測定的分析目標進行了規定，要求總誤差≤12%；不精密度要求CV≤4%，不準確度要求偏差≤4%(與β-定量法測定參考值比較)。
2.標準物質和質控材料：LDL-C標準化的主要難點是缺乏不受基質效應影響或影響甚小，且能長期用于監測LDL-C測定的參考物質與質控材料。目前國內外尚無LDL-C測定的決定性方法與1°級參考材料，NCEP推薦CDC的β-定量法為參考方法，2°級參考材料為CDC冰凍血清(NIST SRM 1951a，CAP RM 026)。CDC的標準化工作也剛開始，首先進行的工作是在膽固醇參考方法實驗室網絡(CRMLN)和脂質實驗室標準化專家組(LSP)實驗室轉移CDC參考方法，使之具有可溯源性。制備參考血清時，如進行加工或添加某些成分(如制備的LDL)，會使某些分析系統出現基質效應，即新鮮血清標本的分析結果出現明顯偏差。CDC研究證明LDL-C對血清冰凍比其他血脂指標敏感，血清冰凍后LDL-C下降(約1.6%)，但LDL-C下降發生在冰凍初期，在以后的貯存中不再下降，說明冰凍血清用于LDL-C參考方法的標準化是可行的［17］。上述幾種測定方法中，以免疫沉淀法對冰凍血清最為敏感，血清冰凍后再復融，LDL-C測定值會明顯下降。目前尚乏見血清冰凍對各種檢測方法結果影響的系統研究報道，總的來說用定值冰凍血清作為參考材料優于凍干品，LDL-C的測定推薦使用新鮮血清。近年陸續引進的自動化檢測方法為LDL-C的檢測提供了方便，但對校準品和質控材料要求更高。一方面希望其能用于方法校準、標準化和質量控制，能用于國際和國內室間質評；另一方面亦希望能同時用于其他項目的校準和質控。這也是當前LDL-C檢測所面臨的難題之一。
3.檢測的標準化：NCEP近來對LDL-C的測定進行了系統回顧與總結，分析了LDL-C測定的變異來源，推薦了LDL-C測定的參考方法與常規方法，并對廠商、保健人員、實驗室及政府機構與專業組織提出了相應的建議。NCEP暫推薦CDC的β-定量法為參考方法，Friedewald公式法為常規方法。國內近年已廣泛推廣化學沉淀法(如PVS法)直接測定LDL-C，這也是必然趨勢，需要引起重視的是方法的合理選擇與測定標準化，這樣可防止臨床應用中因測定結果不準確而造成的混亂。國內現已推行TC測定標準化，也有利于LDL-C標準化工作的開展。當前的任務是對分離條件規范化，同時研制開發出穩定可靠的參考材料與定值血清。目前相繼開發的幾種LDL-C直接測定法有一定臨床應用前景，但需進一步進行系統評價與深入研究探討。