免疫印跡法（western blot） 原理：
通過電泳區分不同的組分，并轉移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質進行檢測，蛋白質的Western印跡技術結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的選擇和制備
A：樣品的制備
1 組織： 組織的處理方法：組織洗滌后加入3倍體積預冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。
2 細胞：細胞的處理方法： 離心收集細胞或者直接往細胞培養瓶內加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超聲波破碎，5000rpm，5mins 離心，取上清。加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分裝后于-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚藍制樣。
B：蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因
1.雙縮脲法：雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法。在需要快速，但不很準確的測定中，常用此法。硫銨不干擾顯色，這對蛋白質提純的早期階段是非常有利的。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白質溶液測定。干擾物有硫醇，以及具有肽性質緩沖液，如Tris、Good緩沖液等。可用沉淀法除去干擾物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質，然后棄去上清液，再用已知體積的1m NaOH溶解沉淀的蛋白質進行定量測定。
2.Lowry法：此法是雙縮脲法的進一步發展。他的第一步就是雙縮脲反應，即Cu++與蛋白質在堿性溶液中形成絡合物，然后這個絡合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑（福林-酚試劑），結果得到深藍色物。此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測定20mg/L～400mg/L含量的蛋白質溶液。其干擾物質與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大，硫醇和許多其他物質的存在會使結果嚴重偏差。另外要注意的是，加入福林試劑時要特別小心，試劑只在酸性pH環境中才穩定，上述提到的還原反應只有在pH10時才發生，因此，福林試劑加入到堿性的Cu2+-蛋白質溶液中時，必須立刻攪拌，以使磷鉬酸-磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2+-蛋白質絡合物所還原。
3.紫外吸收法：大多數蛋白質在280nm波長處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故，因此，利用這個特異性吸收，可以計算蛋白質的含量。如果沒有干擾物質的存在，在280nm處的吸收可用于測定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白質溶液。部分純化的蛋白質常含有核酸，核酸在260nm波長處有最大吸收。
4. Bradford比色法： Bradford比色法比Lowry法測定蛋白濃度更簡單迅速。用脫氧膽酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污劑、2-巰基乙醇、乙酸、硫酸銨、Tris和一些堿性緩沖系統的干擾。分別在兩組微量離心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20祃），以0.15mmol/l NaCl補足至100祃，同時以兩管100祃的0.15mmol/l NaCl作空白對照。每管各加入1ml考馬斯亮藍染料溶液，振蕩混勻，室溫放置2分鐘。用1cm光徑的微量比色杯測A595，取A595吸光值對標準蛋白濃度作圖，畫標準曲線，并測量待測樣品的A595。從BSA標準曲線中確定待測樣品的濃度。測定10-100礸的蛋白質，要在較大試管中將染料溶液體積增大5倍進行。樣品濃度過高，可稀釋后進行，或在10-100礸另作一標準曲線進行測定。
5．電泳估算法：樣品倍比稀釋，SDS-PAGE電泳，同時做定量marker對照，可以估算樣品大概濃度。
以提取癌組織總蛋白為例：
① 取等量胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺組織，用dH2O漂洗5～10次，再用預冷的1×PBS洗滌3次，目的是去除樣本中的血液。
② 每2克組織加入3ml 1×PBS勻漿，保持在4℃條件進行。
③ 加入5×STOP Buffer緩沖液1ml，混勻，4℃下超聲碎化。再加入0.5ml β-ME，0.5ml溴酚藍，煮沸10mins，至此，制樣過程完成；
④ SDS-PAGE電泳，以BAS作為對照估計樣品蛋白濃度。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）
A：實際操作
1. 做膠前的準備
1)檢查是否有足夠的、干凈的 spacer、comb 和架子。
2)檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。
3)按將要檢測的抗體對應的原始抗原的分子量大小，計算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。
2. 制膠，電泳
1）裝好架子。
2)按照下面配方配制分離膠。(單位：ml，Total： 8ml) 7.5％ 10％ 15% 2×Sep. buffer 4 4 4 30％ Gel.sol 2.0 2.7 4 ddH2O 1.9 1.2 0 TEMED 8ul 8ul 8ul 10%APS 80ul 0ul 80ul 在膠上面加入一層蒸餾水，促進膠更好的凝集。
3)待分離膠凝集后，配制濃縮膠。(單位：ml，Total： 3.5ml) 3％ 2×Stacking. buffer 1.7 30％ Gel.sol 0.35 ddH2O 1.4 TEMED 5ul 10%APS 50ul 倒好后插入預先準備好的梳子。
4)待膠凝集好后，上樣，電泳。 上層膠用60-80V電壓，當樣品至分離膠時，用100-120V電壓。一般電泳時間在1.5小時左右。
B ：注意事項及常遇到的問題
1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。
2）上樣蛋白量不應超過30ug/mm2 (載荷面即：如果你的膠槽是5mm×1mm，則載荷面為：1mm×mm=5mm2) 。
3）gel通常在0.5-1h內凝集最好，過快表示TEMED、APS用量過多，此時膠太硬易龜裂，而且電泳時容易燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統實際不純或實效。
4）混合攪拌速度太快產生氣泡影響聚合，導致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。
5）電泳中常出現的一些現象：︶ 條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。︵ 條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。拖尾：樣品溶解不好。紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。條帶兩邊擴散：加樣量過多。
三、轉移在電流的作用下，使蛋白質從膠轉移至固相載體（膜）上。
膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學兼容性。有兩種規格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。 A 半干法即將凝膠夾層組合放在吸有轉印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導電流，起到轉移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉移條件比較嚴酷，但是其轉移時間短，效率高。
1 實驗條件的選擇
電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉移時間，具體可以根據實際適當調整。目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度轉移時間 80---140 8% 1.5-2.0 25---80 10 1.5 15--40 12 0.75 <20 15 0.5 2
2 實驗操作
（1）濾紙和膜的準備 (在電泳結束前20分鐘應開始準備工作)。
A. 檢查是否有足夠的transfer buffer，沒有立即配制。
B. 檢查是否有合適大小的濾紙和膜。
C. 將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉入transfer buffer中。
D. 將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。
PDVF膜在進轉移緩沖液時，要在甲醇里面泡多長時間?
PVDF是疏水性的，在轉膜緩沖液里很難浸透，甲醇處理后使更容易浸潤。 PVDF的預處理是用甲醇浸泡活化，浸泡透之后轉入蒸餾水洗兩次。用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合。一般5-20分鐘都有人在用。可在取膠的同時泡，估計前后5分鐘左右。效果還不錯。以前有站友發貼，說處理時間沒多大關系，關鍵看膜的質量．確實是這樣的。只要讓膜完全浸透應該就沒問題了。 Hybond的PVDF說明書這樣的寫的：“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是，至少10秒鐘，多泡下也沒關系的，事實上，泡10秒的做過，10分鐘的也做過，都沒有問題的。
（2）轉移
A. 在電轉移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。
B. 將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的濕潤。