隨著現代科學技術的不斷發展，特別是免疫學、生物化學、分子生物學的不斷發展，新的細菌診斷技術和方法已廣泛用于食品微生物的鑒別。傳統的細菌分離、培養及生化反應，已遠遠不能滿足對各種病原微生物的診斷以及流行病學的研究。近年來國內外學者不斷努力，已創建不少快速、簡便、特異、敏感、低耗且適用的細菌學診斷方法，尤其是DNA探針和多聚酶鏈反應技術的發展和應用，明顯提高了細菌的診斷水平。
一、快速酶觸反應及細菌代謝產物的檢測
快速酶觸反應是根據細菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應的底物和指示劑，將他們配制在相關的培養基中。根據細菌反應后出現的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應的測定結果有助于細菌的快速診斷。這種技術將傳統的細菌分離與生化反應有機的結合起來，并使得檢測結果直觀，正成為今后微生物檢測發展的一個主要發展方向。Rosa等將樣本直接接種于Granda培養基，經18小時培養后，B群鏈球菌呈紅色菌落且可抑制其他菌的生長。
Delise等新合成一種羥基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的藍，將一定量的IBDG加入到麥康蓋培養基瓊脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培養18小時，出現深藍色菌落者為大腸埃希氏陽性菌株。其色彩獨特，且靛藍不易擴散，易與乳糖發酵菌株區別。
二、免疫學方法檢測細菌抗原或抗體的技術
在細菌診斷中利用免疫學的各種方法日益受到人們的極大關注，從而簡化了病原微生物的鑒定手續。
1．抗血清凝集技術
早在1933年，Lancefield就成功地用多價血清對鏈球菌進行了血清分型。隨著抗體制備技術的進一步完善，尤其是單克隆抗體的制備，明顯提高了細菌凝集實驗的特異性，今天廣泛用于細菌的分型和鑒定，如沙門氏菌、霍亂弧菌等。
2．乳膠凝集實驗
將特異性的抗體包被在乳膠顆粒上，通過抗體與相應的細菌抗原結合，產生肉眼可見的凝集反應。通常此法需獲得細菌純培養物，再將培養物與致敏乳膠反應。業已用于鑒定大腸桿菌O157；H7 。
3．熒光抗體檢測技術
用于快速檢測細菌的熒光抗體技術主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清，經洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結果。間接法是在檢樣上滴加已知的細菌特異性抗體，待作用后經洗滌，再加入熒光標記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體，用于750份食品樣品的檢測，結果表明與常規培養法符合率基本一致。
4．協同凝集試驗（COA）
業已證實，葡萄球菌A蛋白（SPA）具有與人及各種哺乳動物IgG的Fc段結合的能力，而不影響抗體Fab段的活性。近年來國內外學者采用抗體致敏的SPA檢測細菌即協同凝集試驗。如Rahman等用協同凝集試驗鑒定霍亂弧菌O1群的初代分離物做快速篩選，比常規法節省時間，對204份材料用兩種方法比較表明協同凝集試驗具有較高的特異性和敏感性。
5．酶聯免疫測試技術
酶聯免疫技術的應用，大大提高了檢測的敏感性和特異性，現已廣泛地應用在病原微生物的檢驗。
應用酶聯免疫技術制造的mini-Vidas全自動免疫分析儀，是用熒光分析技術通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標生物體，然后以帶熒光的酶聯抗體再次結合，經充分沖洗，通過激發光源檢測，即能自動讀出發光的陽性標本，其優點是檢測靈敏度高，速度快，可以在48小時的時間內快速鑒定沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、單核李斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。
三、分子生物學技術在檢測食源性病原微生物中的應用
隨著分子微生物生物學和分子化學的飛速發展，對病原微生物的鑒定已不再局限于對它的外部形態結構及生理特性等一般檢驗上，而是從分子生物學水平上研究生物大分子，特別是核酸結構及其組成部分。在此基礎上建立的眾多檢測技術中，核酸探針(Nuclear acid probe)和聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction)以其敏感、特異、簡便、快速的特點成為世人矚目的生物技術革命的新產物，業已逐步應用于食源性病原菌的檢測。
1．核酸探針
將已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法標記，加入已變性的被檢DNA樣品中，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區段形成雜交雙鏈，從而達到鑒定樣品中DNA的目的，這種能認識到特異性核苷酸序列有標記的單鏈DNA分子核酸探針或基因探針。
2．核酸探針的類型
根據核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分成DNA探針或RNA探針，一般大多選用DNA探針；根據選用基因的不同分成兩種，一種探針能同微生物中全部DNA分子中的一部分發生反應，它對某些菌屬、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA 發生雜交反應，如編碼致病性的基因組，它對某種微生物中的一種菌株或僅對微生物中某一菌屬有特異性。這類探針檢測的基因相當保守，包括大部分rRNA，因為他既可能在一種微生物中出現，又可代表一群微生物。如應用rRNA探針檢測作為篩選食品污染程度的指示菌E.Coli.選擇探針的原則是只能同檢測的細菌發生雜交反應，而不受非檢菌存在的干擾。
3．核酸探針的應用：
（1）．用于檢測無法培養，不能用作生化鑒定、不可觀察的微生物產物以及缺乏診斷抗原等方面的檢測，如腸毒素。
（2）．用于檢測同食源性感染有關的病毒病，如檢測肝炎病毒，流行病學調查研究，區分有毒和無毒菌株。
（3）．檢測細菌內抗藥基因。
（4）．分析食品是否會被某些耐藥菌株污染，判定食品污染的特性。
（5）．細菌分型，包括rRNA分型。
4、核酸探針的特點: 4.1.探針的特異性: 探針檢測技術的最大優點是特異性，就是說一個適當組建的DNA探針能絕對特異性地與所檢微生物而不與其他微生物發生反應。對食品檢測而言，就是不與樣品中內源性雜菌和樣品自身DNA發生非特異性反應。 以往檢測方法檢測的是基因的表達產物（蛋白質或其他產物）。檢測這種物質受多種因素影響。比如食品中微生物因受應激損傷（高溫、冷凍、化學制劑等）會導致基因組的變化，從而引起其表達產物的變化。而核酸探針檢測的是基因本身，它能識別基因本身的變異，不受基因表達產物的影響。常規免疫學方法檢測抗原、抗體，它們都是蛋白質，這些蛋白質由氨基酸組成，而氨基酸由核苷酸序列確定，一旦這種序列受外界影響發生變異，就會導致其產物的變化，影響抗原抗體間的反應，使檢測特異性下降。 檢測病毒主要通過組織培養后，檢測病毒相關的蛋白質囊膜，即使采用超低溫保存，有時也會引起編碼蛋白質囊膜基因的變化，而采取DNA探針檢測病毒則不用改變其蛋白質結構，而只需檢測是否有相應特異性的編碼蛋白質囊膜的病毒靶DNA序列。 另外，核酸之間的識別連接比抗原抗體準確，并且探針檢測比免疫學方法靈活。盡管看來形成抗原抗體復合物比核酸雜交快，但能通過加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍，從而提高反應速度，核酸比蛋白質耐受高溫（100℃）、有機溶劑、螯合劑和高濃度工作液的破壞能力強，所以用比提取制備蛋白質強烈的多的方法制備核酸，不會影響雜交反應。當然RNA探針除外，因為RNA不耐受堿處理，需用其它方法制備檢測用RNA。 核酸探針的特異性取決于探針的堿基序列和使用條件，如在不嚴格的條件下（低溫高鹽）探針與靶DNA誤交結合力比嚴格條件下穩定。 探針長度也會影響反應的特異性，一般加Formamide增強反應特異性。 4．2．探針的敏感性 研制核酸探針是為了檢測出單個病毒和細菌。DNA探針敏感性取決于探針本身和標記系統。32P標記物通常可檢出10-8摩爾特異DNA片段，相當于0。5pg,1000個堿基對的靶系列，相當于1000---10000個細菌。用親和素標記探針檢測1小時培養物DNA含量在110pg，兩者敏感性大致相同，而血清學方法只能達到1ng的水平。 延長培養時間，增強信號強度能提高探針的敏感性。 制備食品樣品時，因機械均漿而導致菌體破裂，產生較高的背景干擾會影響檢測敏感性。 在探針上加生物素化的核苷酸長尾能使檢測敏感性提高10倍。 細胞中rRNA比DNA多，檢測rRNA的探針比DNA敏感。通過擴增DNA含量也能提高檢測敏感性。 4．3．探針檢測技術中存在的問題 檢測一種菌就需要制備一種探針，目前尚未建立所有致病菌的探針，盡管檢測速度快，但要達到檢測量還要對樣品進行一定時間的培養，任何一種方法不可能有100%的特異性和敏感性，所以必須考慮假陽性和假陰性的問題。 DNA探針還不能完全取得常規檢驗提供的細菌特性的信息，如在菌株生物型鑒定、血清型和抗藥基因上有不足之處。 檢測食品時，樣品中待檢菌量低雜質成分復雜，樣品DNA純度不夠高等都會限制探針檢測的敏感性。 探針檢測是分析基因序列，對毒素污染的食品有時因樣品中不含產毒菌而無法檢測，因為盡管探針能檢測活菌或死菌中存在的靶DNA序列，但它不能檢測其表達產物，所以在評價食品安全衛生上存在一定的局限性。 5．核酸探針雜交技術原理 根據完成雜交反應所處介質的不同，分成固相雜交反應和液相雜交反應。固相雜交反應是在固相支持物上完成的雜交反應，如常見的印跡法和菌落雜交法。事先破碎細胞使之釋放DNA/RNA然后把裂解獲得的DNA/RNA固定在硝基纖維素薄膜上，再加標記探針雜交，依顏色變化確定結果，該法是最原始的探針雜交法容易產生非特異性背景干擾。 液相雜交法指雜交反應在液相中完成，不需固相支持，優點是雜交速度比固相雜交反應速度快5�10倍。缺點是為消除背景干擾必需進行分離以除去加入反應體系中的干擾劑。 分離雜交DNA探針的方法有兩種，一種用羥磷灰石，它僅能與雙股DNA結合，單股DNA在和羥磷灰石結合前必須先同一個探針或互補單鏈雜交成雙股DNA才可。當溶液中DNA通過羥磷灰石柱子時，只有雙股DNA能吸附，然后再把吸附在柱上的DNA洗脫下來，最后用激活的標記物檢測。另一種分離方法運用磁球技術把探針與小磁球連接，再用多核苷酸尾部連接第二探針，不用離心就能分離DNA與未雜交DNA。短寡核苷酸能和磁球連接，也能從磁球上洗脫，在以mRNA系統進行靶循環的檢測過程中，該方法能將背景干擾降低2---3個數量級，從而達到較高的敏感性。 5．1．夾心雜交法（Sandwish hybridization） 它由三種不同作用的核酸成分組成：（1）：與固相支持物連接的捕獲探針；（2）產生信號的檢測探針；（3）靶核酸序列。靶核酸在這個體系中起連接捕獲探針和信號檢測探針的作用。如體系中存在上述三種成分，靶核酸能于上述兩種核苷酸雜交，洗脫去除雜質后能得到一個清晰的檢測信號，如果靶核酸不與上述兩種探針雜交，則信號探針無法連接在固相物上，洗脫后固相物上無信號應答。 5．2．核酸置換雜交分析法 （Strand displacement assay） 它是在夾心雜交法的基礎上改進的一種方法。先獎捕獲探針連接在固相物上，然后在此探針上以微弱的結合方式雜交一個短小能產生信號的核酸，如果靶DNA能與捕獲探針雜交可通過競爭置換出帶信號的核苷酸片段，在檢測過程中產生信號的單股核酸可轉化為ATP，再加入熒光素酶，用生物發光分析法檢測。其優點在于背景干擾小，敏感性強。缺點為不是所有捕獲探針都能應用這種方法雜交，且信號探針會不斷地從捕獲探針上脫落。 5．3．浸染棒法 （Dipstick assay）
非放射性物標記探針在高濃度情況下，由于抑制了非特異性吸附，比放射性物標記探針背景干擾小。
它是夾心雜交法最新的一種改進方法。它用兩種探針，其中一個進行標記，另一個是單核苷酸長鏈，如多聚腺苷酸。浸染棒上包裹與多聚腺苷酸長鏈探針能互補配對的堿基成分，即多聚胸腺嘧啶，盡管雜交反應在溶液中完成，但浸染棒是完成最后檢測的固相支持物。它比薄膜法能更有效地減少背景干擾，提高檢測效率。亦已用于沙門氏菌和李氏菌的檢測。對熒光素標記探針可用辣根過氧化物酶標記熒光素抗體，通過比色法檢測復合物濃度。
6.聚合酶技術（PCR）的原理及其發展
6．1．PCR技術原理
為提高DNA探針的敏感性，可先將靶DNA序列擴增，增加DNA數量，使其達到足夠的檢測量，若反應以動力學為基礎，則能定量分析。1983年Millus 和Cetus發明了最基本的擴增DNA或增加樣品中特殊核苷酸片段數量