我們描述一種大聚合酶鏈反應(PCR)應用的方法，使在已知序列的核心區邊側的未知 DNA成幾何級數擴增。用適當的限制性內切裂解含核心區的DNA，以產生適合于PCR擴 增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環狀分子。PCR的引物同源于環上核心區 的末端序列，但其方向性，使鏈的延長經過環上的未知區而不是分開引物的核心區。 這種反向PCR方法可用于擴增本來就在核心區旁邊的序列，還可應用于制備未知序列 探針或測定邊側區域本身的上、下游序列。
引言
通常測定一個與已知序列相鄰的DNA序列是必要的，例如位于編碼DNA的上游和下游兩 側的區域，轉位因子的插入位點以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色體載體上 的DNA片段末段的未知序列的探針等。這種末端特異探針在Southern Blot或染色體步 查(Chromosome walking)所需的噬菌斑雜交或克隆雜交中都十分有用。
要得到邊側序列的探針一般需要進行一系列費時、費力的工作，首先用內切酶裂解和 用已知邊側序列的探針Southern雜交以確定大小適合于克隆的末端片段;這些片段還 要經過凝膠分離、克隆，得到的物質再與已知邊側區域雜交以確定合適的克隆子。要 測定未吞邊側區序列時，通常需要從克隆中進行各種片段的亞克隆。
為避免這些步驟，我們采用擴展的PCR方法，使相鄰邊側區域得以擴增。典型的PCR擴 增使用與互補鏈雜交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向內跨過兩個引物之 間的區域。一個引物的DNA合成產物作為另一個引物的模板，進行DNA變性、引物退 火，DNA聚合酶管伸反應的多次重復性循環，可使引物規定區域的拷貝數成指數增 加。但用傳統PCR方法得不到緊鄰引物外側的DNA序列，因為寡聚核苷酸所引導的既有 目的DNA又有引物外側區的DNA合成在拷貝過程中只呈線性增長，這種線性增長是因 為，對于每種引物來講，其不能引導DNA反向合成(3'-5').
幾乎是同時，有三個實驗室分別設計出一種方法，使PCR可以擴增邊側區域。該方法 (反向PCR)的基本點是用適當內切酶裂解核心區外分子，使這些酶切片段自身連接形 成環狀分子，從而將邊側區域轉化為內部區域。用與核心區末端同源的引物，但其 3'端趄向未知區域，可以進步用PCR擴增環中的未知區域，該方法如圖1所示。
反向PCR程序
Ochman等[5]，Triglia等[6]和Silver、Keerikatte[7]的文章中詳細地描述了反向 PCR的不同應用，下面是Ochman[1]等描述的方法概要。
用傳統的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3-4kb。在許多情況下，首先 需要進行Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適于環化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游 或上游區，而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增，并帶有由內切酶和環化類 型決定的接點(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。對于擴增左翼或右翼序列，初試時 最好靠近識別上個堿基位位的酶，并已知在核心區有其方便的裂解位點。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點。
用T4連接酶在稀DNA濃度下環化更容易形成單環[8]。在一些實驗中，為產生對反向 PCR大小適當的DNA片段需要兩種內切酶，但這樣所產生的片段末端則不適于連接，環 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內切 酶失活。在我們實驗中，不必裂解環狀分子核心區也可得到有效的PCR擴增。(這顯然 不同于Silver和Keerikatter[7]的實驗結果，他們報道在核心裂解使模板線性化后， PCR擴增率增加100倍，但Triglia[5]等則發現裂解環狀分子與加熱引起隨機缺口效果 相同)。
聚合酶鏈反應條件與經典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進行30個循環。可改變PCR條件以生產特異產物。將反向 PCR用于測序時，與核心區末端后部結合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增部 分的核心序列與未知邊側序列間的接點更近，減少了擴增引物的干擾。
反向PCR的應用
邊側區域的擴增
反向PCR的應用已經證明該方法可以避免不方便的克隆和亞克隆步驟，因此可解決大 量問題。我們最初用反向PCR擴增E.coli(Escherichiacoli)天然分離物中轉位插入序 列ISL的邊側序列;Triglia[6]等將反向PCR用于編碼瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum) 主裂殖子表面抗原前體的基因，在實驗中，他們用RsaⅠ酶裂解基因組DNA，連接，得 到的環再用HinfⅠ在內部位點酶切，然后進行擴增，得到預期的297bp大小的片段， 并用DNA直接測序進行鑒定。他們認為反向PCR由于具有從全長cDNA得到序列信息的優 點，將對步查現轉錄基因的5'端或3'端的邊側區域有用。
反向PCR的另一個應用是Silver和Keerikatte進行的[7]。他們將其應用于擴增拉于整 合在小鼠細胞中的外生原病毒DNA邊側的細胞DNA。除強調反向PCR在染色體“步查” (Walking)或“跳查”中的用途，他們還指出，該技術用于擴增特征性弱的序列，這 些序列在E.Coli或其他宿主載體系統中很騅或不能克隆。
末端特異探針的制備
我們已改進反向PCR方法以得到在酵母人工染色體（YACS）[1]中的插入載體接頭處的 特異探針。YACs庫建立于果蠅(Drosophilamelanogaster)OregonR種的高分子量DNA 上，有約平均大小170kb的插入。因為反向PCR可擴增果蠅插入子的特異末端，用YAC 載體任一臂上的一已知序列作核心區即可擴增，得到的DNA片段可用作探針檢測所建 庫中重疊和相鄰的克隆序列[1]。
許多果蠅YAC染色體含有很大的插入區，可以與唾液腺多線染色體上幾個相鄰的主帶 雜交。通過反各PCR人這些YAC克隆中產生末端牧場劃1片段用于原位發交，也可以確 定插入DNA的方向。而且，許多YAC克隆含有中度或高度重復DNA序列，它們不能直接 用來探測文庫以確定重疊克隆。圖2為反向PCR產生的生物素標記的末端特異探針對果 蠅多線染色體的原位雜交。該探針含約1.3kb果蠅DNA，來自位于染色體2R染色體頂部 圖中的一個120kb的YAC3'端。除了有助于確定具體YAC克隆的方向外，反向PCR產生的 末端特異DNA片段也克服了在含有重復DNA序列克隆的定位中的問題及制備毫克級特異 YAC探針用于染色體步查和雜交中的問題。
反向PCR產生的特異末端片段與黑腹果蠅多線染色體雜交。染色體2R頂端黑色區 域為從含果蠅基因組DNA的酵母人工染色體上進行反向PCR擴增的產物與染色體2R雜交 所至。
反向PCR的應用和局限
如Ochman等，Silver和Keerikatte所述，反向PCR在研究轉座因子、反轉錄病及其他 能與基因組DNA整合或易位的DNA序列中有許多重要應用。這些應用包括序列的易位、 轉座和基因融合，其中之一是已知序列，例如癌基因或免疫系統的基因組成。在所有 這些情況中，如已知序列插入未知序列或與未知序列并列，反向PCR可用于測定未知 邊側序列。反向PCR的主要優點是簡單快速，可以研究許多獨立克隆。其某些應用適 合于臨床診斷。
目前反向PCR的局限之一是由未知邊側序列性質引起的，需用幾種酶試驗以選擇產生 大小合適的片段的內切酶。另一局限是許多常用內切酶也在不適當位點裂解載體序 列。但一旦確定合適的內切酶，反向PCR方法是直接了當和可靠的。
大多數真核基因組含大量中度或高度重復序列，YAC或科斯粒中未知接點序列有時也 包括這些序列。通過反向PCR擴增得到的探針可與許多基因組序列雜交，但它們在用 于染色體的步查或跳查方面會受到限制，在這種情況下，需要進行亞克隆。
