核酸熒光染色技術在血液分析儀的最新應用

吳俊

一概述

　　目前，五分類血液分析儀已經為許多大中型醫院實驗室所使用。五分類儀器不同于三分類儀器的主要區別在于：為了精確定量地檢測白細胞的五種成份，各種五分類血液分析儀開始采用多種物理學原理（電阻抗、光散射、高頻波技術），甚至設置專用檢測通道和化學染色方法檢測數目最少的嗜酸、嗜堿性粒細胞。

　　而高檔次的五分類血液分析儀，除了檢測正常白細胞五項分類以外，還致力于高靈敏地檢測幼稚、異常成份。對于外周血中的幼稚成份，過去一般依賴于顯微鏡鏡檢。而普通血液分析儀對異常標本報警的靈敏度有限，常常造成漏報。或者為了減少這種情況而提高陽性報警率（通過降低儀器報警的閾值），提高了復片的比例從而造成假陽性率偏高，失去了過篩的意義。鑒于以上這些問題， SYSMEX 近年來開始致力于通過化學染色方法對幼稚成份的標本進行自動化檢測，這相對于一般的陽性報警（即提供一種可能性）要進步了很多。

　　對于紅細胞系統，幼稚成份主要是網織紅細胞和有核紅細胞檢測，提供定量的參數甚而可以對 RET 成熟度作進一步的分類。在白細胞中，幼稚成份根據形態學的不同包括原始細胞、核左移細胞、幼稚粒細胞、異常 / 異型淋巴等。能否采用特殊的方法學（如核酸染色方法）高靈敏度地測得幼稚白細胞的存在，甚至提供定量的參數，是儀器優劣的標志之一。除了幼稚細胞以外，其它一些異常標本的檢出率和準確性也通過技術的進步而得到提高。對于巨大血小板、血小板凝集、小紅細胞或細胞碎片等標本，使用傳統的電阻抗原理往往無法準確測的，而新的核酸染色技術結合光學流式原理則可以較好地解決。 因此，可以靈敏、準確地檢測出幼稚的紅、白細胞存在（而非提供可能性），并具有血小板的形態辨識功能，成為血液分析儀發展的最前沿的功能。

二 核酸熒光染色技術

• 在白細胞系分析的應用

a. 正常五項分類的分析應用

　　由于電阻抗原理的局限性，二分群、三分群儀器都無法準確地檢測出淋巴、單核、嗜酸性、嗜堿性、嗜中性細胞。為了能夠從細胞體積大小到內部結構全面分析細胞并得到準確的白細胞分類結果，各種型號的五分類儀器采用了各項技術聯合應用于血液細胞的分析，包括物理原理（電阻抗、散射光、高頻波 / 射頻等）、化學原理（特異性溶血、普通顆粒染色、酶染色、核酸染色）。

　　在最新推出的 SYSMEX XE-2100 系列、 XT-2000i/1800i 系列五分類血液分析中，半導體激光作為光源將光束照射在流式細胞室內的白細胞，通過不同角度的散射光可以反映細胞外部的體積和內部顆粒復雜程度的信息（圖 1 ）。其中側向信號用以反映細胞內部信息（主要是顆粒的復雜性）。試劑中增加了特異性針對 DNA/RNA 染色的熒光染料 Polymethine( 聚次甲基染料 ) 。激光照射后產生熒光信號，和側向散射光一道繪制成二維散點圖進行白細胞分類。

b. 幼稚白細胞分析的應用

　　白細胞中的幼稚成份在臨床上具有顯著意義。過去，此類標本主要依靠人工鏡檢。隨著血液分析儀檢測技術的發展，儀器對于幼稚白細胞的報警提示越來越靈敏。

　　通過一些特異性的化學手段，五分類儀器還可以進行幼稚白細胞的定量檢測（圖 3 ）。 SYSMEX XE/XT 系列采用核酸熒光染色后，根據細胞成熟度的不同可

　　以體現在其熒光信號的強弱上，其白細胞分類通道出正常細胞分類外，還有兩個幼稚白細胞的定量參數： IG （幼稚粒細胞）和 Other （原始細胞 / 異常淋巴）。臨床研究表明 IG 可以作為感染性疾病、白血病、炎癥的有用參數，另外也提示治療的預后和療效監測

2. 在紅細胞、血小板系分析的應用

a. 光學染色法檢測 PLT

　　通過光學技術，可以在一定程度上改善電阻抗原理僅僅判斷細胞體積所帶來的局限性，提高了紅細胞和血小板的準確性。而現代生物染色技術的發展，使更加特異性的核酸染色法與光學技術結合成為可能。在 SYSMEX XE-2100 、 XT-2000i 血液分析儀上，檢測血小板的方法增添到兩種。儀器的紅細胞和血小板檢測通道采用鞘流電阻原理，常規標本即以此為檢測手段。當一些特殊標本混有大型血小板或小球性紅細胞時，二者之中會有一部分具有相同的體積使電阻法無法準確區分，儀器還可以使用光學染色法檢測 (633nm 波長的半導體激光束，染料為 Plymethine 和 Oxazine) 。血小板由于體積較小，但顆粒中存在有少量 RNA ，被染料輕微著色而激發出熒光，此時得到的血小板結果更加可信。（詳見圖 4 ）

b. 網織紅細胞分析

　　網織紅細胞是晚幼紅細胞脫核后與成熟紅細胞之間的過渡細胞，是反映骨髓造血功能的重要指標。目前用自動分析儀進行網織紅細胞分析的技術已經取得很大進展。

　　隨著五分類儀器技術日臻發展， Sysmex XE-2100 、 XT-2000i 具備了內置式的全自動網織紅檢測功能。采用激光流式原理和細胞核酸染色。除了進行自動的 RET 數目和百分比計數外，還可以通過核酸染色得到的熒光信號強度區分低、中、高熒光強度的網織紅（ LFR 、 MFR 、 HFR ）。由于幼稚的網織紅熒光信號較強， MFR 和 HFR 之和即反映未成熟網織紅的一個有用參數。

b. 有核紅細胞分析

　　有核紅細胞作為幼稚的紅細胞在治療監測和鑒別診斷時有重要臨床意義。而且，有核紅細胞體積與淋巴細胞相仿或略小，大多數儀器對這樣的標本往往會誤計，這樣不但漏報了病理標本，而且造成白細胞（淋巴細胞）結果假性升高。隨著五分類儀器的出現，儀器報警系統開始可以提示其存在的可能性，供操作人員鏡檢復核。

　　真正采用染色手段來自動化地定量檢測有核紅細胞的功能，出現在 SYSMEX

　　XE-2100 和 XE-2100L 上（圖 5 ）。 XE-2100 儀器單獨設置檢測有核紅細胞的通道，特殊的溶血素將紅細胞完全破壞，有核紅細胞被裸核并收縮，而白細胞被保留。核酸熒光染色 Polymethine 對標本染色后，白細胞細胞核和胞質內核酸的染色總量遠大于同樣被染色但被收縮的有核紅細胞，通過半導體激光照射后熒光信號和前向散射光信號均有區別。由此準確計得有核紅細胞數目及占白細胞的比例。

三 小 結

　　在當今實驗室五分類儀器逐漸普及的情況下，實驗室對五分類儀器的要求也在逐漸提高。保證正常白細胞五項分類結果準確計數、全自動分析網織紅細胞等已經成為實驗室的基本需求。而為臨床和實驗室最為關注的幼稚白細胞、異常血小板、有核紅細胞有效測定問題，則成為制造商、實驗室用戶關注的焦點。核酸熒光染色技術在血液分析儀應用以后，上述問題在 SYSMEX 的 XE/XT 系列五分類儀器上基本得到較好解決。

　　美國 FDA 于 2001 年 12 月 4 日制定了最終的指導綱要（第一個文件在 2000 年發布），題為： “ 二級特殊控制指導性文件：針對幼稚和異常細胞的全自動細胞計數分類裝置上市前公告；給制造業和 FDA 的最終指導性綱要 ” 。允許制造商開發并推廣有臨床實用意義的新參數，并要求經過嚴格的臨床研究、數據處理和 FDA 認可。根據該指導綱要， SYSMEX 開發并申請通過的參數有：未成熟網織紅參數（ IRF ） ——1997 年 8 月通過 FDA ； 有核紅細胞（ NRBC ） ——1999 年 11 月通過 FDA ；造血祖細胞（ HPC ） ——2002 年 4 月通過 FDA ；未成熟粒細胞（ IG ） ——2003 年 9 月通過 FDA 。